胡 宇，茍惠天

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

細(xì)菌感染已造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失。由細(xì)菌引起的人膿毒血癥是高收入國(guó)家的第十大死因[1]。此外，醫(yī)院是病原菌發(fā)生的自然場(chǎng)所，歐洲每年有410萬(wàn)患者受到與醫(yī)療衛(wèi)生有關(guān)的感染。在美國(guó)，醫(yī)院感染每年導(dǎo)致10萬(wàn)人死亡。食品工業(yè)也極易受到細(xì)菌污染。2015年，180萬(wàn)人死于食用受感染的食物或水。所有這些都需要迅速和可靠地檢測(cè)和鑒定細(xì)菌。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是先分離培養(yǎng)目標(biāo)菌，然后進(jìn)行生化鑒定。該方法雖然便宜，但大多需要72 h才能得到檢測(cè)結(jié)果。這在醫(yī)療、食品加工等行業(yè)由于檢測(cè)耗時(shí)，顯示出很大弊端。隨即，出現(xiàn)一些新的檢測(cè)方法，如PCR方法、DNA芯片、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和質(zhì)譜分析等[2-4]。但以上方法都需要專業(yè)的設(shè)備，操作者具有一定的專業(yè)技能，而且費(fèi)用昂貴。另外，核酸為基礎(chǔ)的各種分析方法在細(xì)菌死亡的情況下容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，PCR方法敏感性很高，不同的菌株或突變體可能無(wú)法得到正確的鑒定?；诿庖邔W(xué)的各類檢測(cè)方法，在很大程度上又受到抗體的限制。綜上，近年來將生物傳感器應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)，被認(rèn)為是一種很有發(fā)展前景的方法[5,6]。

噬菌體是特異性感染細(xì)菌的一類病毒，它們對(duì)宿主細(xì)菌的天然親和力可用于設(shè)計(jì)高度特異性的工具。由于自然界存在大量形狀和性質(zhì)不同的噬菌體，因此可以設(shè)計(jì)檢測(cè)幾乎所有細(xì)菌菌株的生物傳感器。鑒于噬菌體對(duì)細(xì)菌具有高特異性，因此可以篩選到一些選擇性檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的噬菌體。另外，與抗體不同，噬菌體的批量生產(chǎn)簡(jiǎn)單且廉價(jià)，通過感染細(xì)菌溶液即可獲得大量的子代噬菌體。這些優(yōu)勢(shì)使噬菌體成為生物傳感器和其他分析中進(jìn)行細(xì)菌識(shí)別的首選物質(zhì)[7]。

在細(xì)菌檢測(cè)中，基于噬菌體的生物傳感器有幾種可能的設(shè)計(jì)。最直接的是利用野生型噬菌體，因?yàn)樗鼈冊(cè)谧匀唤缰袩o(wú)處不在。也可對(duì)噬菌體進(jìn)行基因工程改造，改造修飾后可更好地應(yīng)用在一些特殊的細(xì)菌檢測(cè)中[8]。最初，利用噬菌體分型方法可對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定。該方法主要通過觀察是否形成特性噬菌斑來判定。隨后，噬菌體還用于細(xì)菌的檢測(cè)。例如，噬菌體可以作為簡(jiǎn)單的識(shí)別元件，將靶細(xì)菌和檢測(cè)中的其他化合物（標(biāo)記物等）進(jìn)行連接。噬菌體沉積在固體基質(zhì)上形成傳感層，結(jié)合適當(dāng)?shù)膫鞲衅骱螅愠蔀閭鹘y(tǒng)意義上的生物傳感器。另外，細(xì)菌檢測(cè)中還可通過判定噬菌體的擴(kuò)增和細(xì)菌裂解物的釋放來實(shí)施。針對(duì)細(xì)菌檢測(cè)中的噬菌體不同研究，綜述如下。

1 噬菌體作為檢測(cè)信號(hào)

噬菌體感染過程導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)噬菌體擴(kuò)增，并在細(xì)菌裂解后釋放噬菌體。在此過程中釋放的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含有多種化合物，對(duì)它們的選擇性檢測(cè)可作為細(xì)菌存在的標(biāo)志。例如，Chen等在T7噬菌體介導(dǎo)的靶細(xì)菌裂解后檢測(cè)到β-半乳糖苷酶的釋放[9]。β-半乳糖苷酶能使氯酚紅β-d-半乳糖苷由黃色變?yōu)榧t色，從而使比色分析成為可能。利用該方法可檢測(cè)到濃度為104CFU/ml 的大腸桿菌。隨后，Chen等利用釋放的β-半乳糖苷酶催化生成對(duì)氨基酚(PAP)，PAP還原離子銀，在金納米顆粒上形成銀層，導(dǎo)致表面等離子體共振峰的藍(lán)移，但該方法并沒有提高檢測(cè)限。另一種方法，是將檢測(cè)β-半乳糖苷酶，基因修飾噬菌體以及電化學(xué)三者結(jié)合起來[10]。基因修飾后的T7噬菌體在大腸桿菌內(nèi)引起β-半乳糖苷酶的過量表達(dá)，催化PAP生成，然后用伏安法檢測(cè)PAP。除了β-半乳糖苷酶，熒光素酶，蛋白酶或堿性磷酸酶也被證明可用于這種檢測(cè)。這些方法的操作原理基本相同，都是基于酶催化與發(fā)光產(chǎn)物的反應(yīng)。

噬菌體感染細(xì)菌的內(nèi)在作用是將許多子代噬菌體釋放到環(huán)境中。在細(xì)菌感染的溶液中加入少量特異噬菌體，會(huì)導(dǎo)致樣品中噬菌體濃度迅速增加。噬菌體數(shù)量的增加被證明是細(xì)菌檢測(cè)的另一個(gè)理想信號(hào)。Anany等研究表明，大腸桿菌感染中產(chǎn)生的子代噬菌體可以用實(shí)時(shí)定量PCR來檢測(cè)[11]。該方法對(duì)布魯氏桿菌的檢測(cè)也有一定的參考價(jià)值[12]。Rees等展示了一種基于串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的技術(shù)，用于檢測(cè)胰蛋白酶消化K噬菌體后，形成的蛋白質(zhì)和多肽。該方法也適用于金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素敏感性的測(cè)定。如果在含有抗生素的樣本中檢測(cè)到噬菌體擴(kuò)增，則認(rèn)為該樣本對(duì)這些抗生素具有耐藥性[13]。另外，通過橫向免疫層析（LFI）也可檢測(cè)噬菌體。Cox等報(bào)道，橫向流動(dòng)導(dǎo)致染色的納米粒子與從炭疽芽孢桿菌中釋放的子代噬菌體結(jié)合，然后，將這種標(biāo)記的噬菌體濃縮在膜上，即形成可肉眼觀察的有色線[14]。

利用噬菌體在不裂解宿主細(xì)菌的情況下，也可以檢測(cè)細(xì)菌。其原理是利用基因工程方法制備報(bào)告噬菌體，感染細(xì)菌，進(jìn)入溶原循環(huán)后在完整細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。Vinay等使用具有編碼綠色熒光蛋白（GFP）的溫和噬菌體HK620和P22分別感染大腸桿菌和沙門氏菌。GFP在感染的細(xì)菌內(nèi)表達(dá)并被檢測(cè)[15]。此外，編碼熒光素酶的噬菌體也可用于細(xì)菌檢測(cè)。Sharp等用編碼熒光素酶的溫和噬菌體φV10感染大腸桿菌，在加入熒光素后產(chǎn)生強(qiáng)烈的發(fā)光信號(hào)，此方法能夠在2 h內(nèi)檢測(cè)到105CFU/ml的大腸桿菌。Wu等改造PP01噬菌體，使其攜帶與外殼蛋白融合的四半胱氨酸標(biāo)簽。該噬菌體感染大腸桿菌產(chǎn)生子代噬菌體后，用膜滲透染料標(biāo)記四半胱氨酸標(biāo)簽來染色細(xì)菌，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡即可檢測(cè)單個(gè)細(xì)菌[16]。

2 利用噬菌體形成傳感層

使用噬菌體檢測(cè)細(xì)菌的方法，是將噬菌體顆粒固定在固體基質(zhì)上作為特異性生物受體。Bennett等1997年首次報(bào)道了通過固定的噬菌體捕獲宿主細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)的技術(shù)。對(duì)于噬菌體傳感層，選擇適當(dāng)?shù)膫鞲衅饕詫?shí)現(xiàn)信號(hào)讀出，顯得尤為重要[17]。Srivastava等在納米硅平臺(tái)上用4-氨基苯硫酚和戊二醛修飾銀薄膜，然后在其表面固定T4噬菌體，利用表面等離子體共振技術(shù)（SERS）提高細(xì)菌檢測(cè)的敏感性，檢測(cè)限為102CFU /ml[18]。Horikawa等利用包被噬菌體的磁彈性生物傳感器來檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，通過共振頻率的實(shí)時(shí)變化，能夠精確測(cè)量超低濃度的細(xì)菌[19]。

近年來，利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)的報(bào)道越來越多。Bhardwaj等利用固定的噬菌體對(duì)石墨烯電極上的金黃色葡萄球菌進(jìn)行選擇性檢測(cè)[20]。另外，利用EIS獲得的生物傳感器性能穩(wěn)定，檢測(cè)范圍廣，靈敏度高。該技術(shù)還可用于分析原始樣品（屠宰污水，血液等）。Moghtader等將碳電極和EIS技術(shù)結(jié)合，用金納米顆粒包被石墨電極，隨后再用T4噬菌體包被，這樣不僅增加金納米顆粒的表面電導(dǎo)率，而且還能有效固定噬菌體[21]。除了電化學(xué)阻抗譜，也有學(xué)者提出了其他電化學(xué)方法。在檢測(cè)細(xì)菌銅綠假單胞菌時(shí)，電化學(xué)發(fā)光被用于檢測(cè)與PaP1噬菌體綴合的羧基石墨烯層的信號(hào)[22]。

隨后，大量研究都集中在改進(jìn)噬菌體傳感層的性能。最直接的方法是通過增加定向噬菌體的數(shù)量來增強(qiáng)信號(hào)。Wang等提出一種噬菌體在聚羥基鏈烷酸酯表面沉積的新方法，同時(shí)提出該表面的噬菌體數(shù)量不應(yīng)超過一定限度，覆蓋率過高會(huì)導(dǎo)致噬菌體間的空間位阻[23]。Olsson等人對(duì)最佳噬菌體覆蓋率進(jìn)行了分析，提出超過95%的噬菌體在傳感層中具有共同的定向結(jié)構(gòu)，包括頭部和具有纖維組織的尾部。受體結(jié)合蛋白就位于纖維末端和尾部，噬菌體只能用一端檢測(cè)并結(jié)合細(xì)菌。因此，噬菌體定位對(duì)于有效檢測(cè)細(xì)菌至關(guān)重要。有研究報(bào)道，將噬菌體的頭部進(jìn)行重組修飾，使其能與傳感器表面上抗生物素蛋白相結(jié)合。也有利用非基因工程方法，進(jìn)行噬菌體定向的報(bào)道。噬菌體具有帶負(fù)電的頭部和帶正電的纖維尾部，因此可以通過靜電作用或在電場(chǎng)中進(jìn)行定向。與物理吸附的噬菌體相比，表面化學(xué)修飾與交替電場(chǎng)相結(jié)合的方法，導(dǎo)致傳感層的靈敏度增加60倍，檢出限提高到100 CFU/ml[24]。

3 利用噬菌體捕獲靶細(xì)菌

噬菌體在細(xì)菌檢測(cè)中可作為生物復(fù)合物的一部分。通常，噬菌體與特定的納米顆粒結(jié)合，用于制備靶向細(xì)菌的生物復(fù)合物，即可從復(fù)雜樣品中分離或檢測(cè)細(xì)菌。磁分離技術(shù)不需要額外的離心或過濾。此外，還能夠?qū)⒛繕?biāo)細(xì)菌與復(fù)雜樣本中的其他成分有效分離，從而最大限度地減少信號(hào)收集過程中的基質(zhì)干擾。Liebana等首次提出，P22噬菌體固定在甲苯磺酰化的磁性顆粒上，可以特異性捕獲和預(yù)濃縮沙門氏菌，之后再通過電化學(xué)磁傳感器檢測(cè)細(xì)菌，可使檢出限降至3 CFU/ml[25]。但檢測(cè)程序復(fù)雜，設(shè)備試劑昂貴等缺點(diǎn)在很大程度上限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此，有學(xué)者提出將噬菌體分離與RT-PCR結(jié)合。利用磁分離技術(shù)，從樣品中分離大腸桿菌O157: H7后，噬菌體感染導(dǎo)致大腸桿菌裂解并釋放內(nèi)容物，通過RT-PCR定量檢測(cè)釋放的DNA，所有測(cè)定在2 h內(nèi)完成，LOD為102CFU/mL[26]。

也有研究將磁分離與酶比色檢測(cè)相結(jié)合。Laube等將該方法用于沙門氏菌的快速檢測(cè)。首先，沙門氏菌被經(jīng)過修飾的噬菌體-磁性納米顆粒復(fù)合物捕獲，依次加入與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合的特異性抗沙門氏菌抗體及底物(四甲基聯(lián)苯胺，TMB)后，在450 nm處測(cè)定吸光度。該方法在2.5 h內(nèi)便獲得了牛奶樣品中19 CFU/ml的檢測(cè)限[27]。更有研究，將大腸桿菌的T4噬菌體與雙功能磁熒光微粒子共價(jià)結(jié)合。磁性促進(jìn)捕獲細(xì)菌的分離，熒光使細(xì)菌-生物結(jié)合物的簡(jiǎn)單分析成為可能，利用流式細(xì)胞術(shù)使整套細(xì)菌檢測(cè)在15 min內(nèi)即可完成。由于檢出限較低，該方法適用于快速、特異的篩選試驗(yàn)[28]。細(xì)菌磁性分離技術(shù)能夠?qū)⒛繕?biāo)細(xì)菌與樣品的其他組分離，無(wú)需任何預(yù)富集。因此，可以大大縮短整個(gè)細(xì)菌檢測(cè)分析的時(shí)間。

4 結(jié)語(yǔ)

利用噬菌體檢測(cè)細(xì)菌的相關(guān)研究已有諸多報(bào)道。但由于種種原因，基于噬菌體的診斷方法仍然只有少數(shù)被商業(yè)化應(yīng)用。近年來，生物傳感器、納米技術(shù)等新型技術(shù)的介入，有效提高了檢測(cè)方法的靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。但進(jìn)一步的發(fā)展仍需要生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等多學(xué)科密切合作，才能提出快速、敏感、低廉的檢測(cè)方法。