劉艷豐，唐淑珍，王文奇，王承敏

（新疆畜牧科學(xué)院飼料研究所，烏魯木齊 830013）

沙棘生長具有耐寒冷、耐干旱和適應(yīng)性強等特性，非常適宜新疆種植。 現(xiàn)新疆的天然林面積、人工種植面積也在逐漸擴大[1]。 沙棘的根、莖、葉都含黃酮，但以葉中含量最高[2]。 黃酮有諸多生物活性和藥理作用，如抗氧化和清除氧自由基，降低血糖、血脂、尿糖，增強機體的免疫因子和免疫系統(tǒng)等功效[3]。利用超聲波法提取沙棘的活性物質(zhì)，我國學(xué)者進行了大量的研究（孫天宇,2012[4]；金鐘，2014[5]），但不同學(xué)者的方法各具特色，如何開發(fā)新疆沙棘資源，提取其黃酮尚未有相關(guān)論著。本試驗選擇含黃酮較多的沙棘葉進行超聲波提取，同時對提取的不同影響因子進行比較，來考察超聲波提取方法對沙棘黃酮提取率的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗原料及其預(yù)處理

試驗原料：沙棘葉，取自新疆青河縣沙棘連片種植區(qū)。 將從沙棘樹上剪下的嫩枝在陰涼處經(jīng)過4～5 d陰干，每天多次翻曬，防止霉變。 將枝條和雜物全部篩選干凈后裝袋，帶回實驗室，待用。

1.1.1 去脂參照Upendra 等(2008)[6]的方法進行。 將經(jīng)過挑選、整理、去刺的沙棘葉，在65 ℃下烘干，粉碎后過40目篩。 在500 mL 燒杯中加入沙棘葉粉末30 g，加入150 mL 石油醚，室溫狀態(tài)下，浸泡1 h，提取低極性物質(zhì)（油脂、色素等），極低性物質(zhì)可能會影響黃酮的提取與測定。 沙棘需要經(jīng)過浸提除雜后，多次洗滌至濾液無色，常溫干燥濾渣即為脫脂后沙棘葉粉末。

1.1.2 酶解

在500 mL 燒杯中加入去脂的沙棘葉粉末30 g，加90 mL 水浸泡，用鹽酸調(diào)節(jié)pH=4，加入0.5%纖維素酶充分?jǐn)嚢?，?0 ℃恒溫水浴保溫1.5 h。 洗滌數(shù)次，常溫干燥濾渣即為酶解后沙棘葉粉末。

1.2 提取工藝

沙棘葉黃酮提取以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和超聲功率為自變量，以沙棘葉黃酮含量為考察指標(biāo)。準(zhǔn)確稱取經(jīng)過去脂和酶解的5.000 g 沙棘葉粉末，小心放入250 mL 具塞三角瓶底部，加入相應(yīng)的提取溶劑，攪拌均勻后，將三角瓶置于超聲波儀中進行超聲提取，提取完成后，將提取液過濾，濃縮至干，即得沙棘總黃酮。

1.3 沙棘黃酮含量的測定

1.3.1 單因素試驗和優(yōu)化

以沙棘葉為研究對象，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間和超聲功率為試驗因子，以沙棘葉黃酮提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗，確定沙棘葉黃酮提取的不同因素的最佳節(jié)點。 在此基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間、超聲功率等條件進行正交設(shè)計試驗優(yōu)化設(shè)計，見表1。

表1 超聲波提取正交試驗水平和因素

1.3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的沙棘葉粉1.000 g， 放進具塞的三角瓶里，加入35 mL 的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，體積分?jǐn)?shù)為60%、65%、70%、75%、80%和85%的乙醇為提取溶劑，在溫度40 ℃，超聲功率100%的條件下超聲30 min，然后過濾，濾液用氮吹儀吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待測液，測定每次的吸光度值，每次重復(fù)做3 次平行試驗。

1.3.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后沙棘葉1.000 g， 放進具塞的三角瓶里，與75%的乙醇溶液混合，在溫度40 ℃，超聲功率100%，并在1：20、1：25、1：30、1：35、1：40 和1：45 的條件下，超聲處理30 min，然后過濾，濾液用氮吹儀吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待測液，測定每次的吸光度值，每次重復(fù)做3 個平行實驗。

1.3.1.3 超聲時間對總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后沙棘葉1.000 g， 放進具塞的三角瓶里，加入75%的乙醇，并以1：35 的料液比混勻，在溫度40 ℃，超聲功率100%的條件下，分別提取20、25、30、35、40 和45 min，然后過濾，濾液用氮吹儀吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待測液，測定每次的吸光度值，每次重復(fù)做3 次平行實驗。

1.3.1.4 超聲功率對總黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后沙棘葉1.000 g，放進具塞的三角瓶里，與75%的乙醇溶液混合，在料液比為1：35，溫度40 ℃，超聲功率分別為50%、60%、70%、80%、90%和100%時，提取30 min，然后過濾，濾液用氮吹儀吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待測液，測定每次的吸光度值，每次重復(fù)做3 個平行實驗。

1.3.2 沙棘黃酮的超聲波正交試驗設(shè)計

選定乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間、超聲功率這4 個對超聲提取影響顯著的因子作為正交設(shè)計試驗的測定因素，每個因素設(shè)立三個水平，按照正交試驗的L43 進行設(shè)計如表1 所示。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱量于120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用95%乙醇溶解后，定容至50 mL 容量瓶中，分別量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 分裝到6 個50 mL 容量瓶， 每個容量瓶加入0.5 mL 1%的A1C13溶液(溶劑為95%乙醇)，用95%乙醇定容至刻度，在避光處靜置10 min，用紫外分光光度計UV2000 在430 nm 處測定其吸光度。 得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程。

1.4 儀器和試劑

紫外可見分光光度儀UV2000(尤尼柯（上海）儀器有限公司生產(chǎn))；恒溫水浴鍋B-260(上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn))；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器制造廠生產(chǎn))；所用乙醇、乙酸乙酯均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。

1.5 沙棘葉黃酮含量測定

將制備的沙棘葉黃酮溶解于95%乙醇中，加入1%A1C13（溶劑為乙醇）溶液0.5 mL，定容至50 mL 容量瓶中，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外分光光度法測定。

計算式為R=cv*100%/m

式中V—定容體積，m—樣品質(zhì)量

2 結(jié)果和分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在430 nm 吸收波長處， 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，AlCl3為顯色劑， 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程結(jié)果為y=0.6341x-0.0115(見圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取沙棘葉黃酮的提取率如圖2 所示。 從圖2 中可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%增加到75%時，提取率顯著提高（P＜0.05），從60%提取率0.72%提高到75%時的0.79%。 但是，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率表現(xiàn)出下降的趨勢（P＞0.05）。 所以本試驗以75%乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳。

2.3 料液比的確定

不同料液比提取沙棘葉黃酮的提取率如圖3 所示。從圖3 中可以看出，隨著料液比的降低，提取率表現(xiàn)為先升后降的趨勢；當(dāng)料液比達到1︰35（g/mL）時，提取率達到最高（P＜0.05）。為節(jié)省提取溶劑和成本，以1︰35（g/mL）的料液比為最佳。

2.4 超聲時間的確定

不同超聲時間提取沙棘葉黃酮的提取率如圖4 所示。從圖4 中可以看出，隨著超聲時間的延長，提取率顯著增加，但在45 min 后增加速度趨緩。 因此本試驗選擇提取時間為45 min 為超聲時間節(jié)點。

2.5 超聲波功率的確定

不同超聲波功率提取沙棘葉黃酮的提取率如圖5 所示。從圖5 中可以看出，隨著超聲波功率的增加，黃酮提取率先增加后降低，在90%時達到最大，隨后有所降低，但差異不顯著（P＞0.05）。 因此本試驗以90%的超聲波功率為最佳。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

圖3 料液比的影響

圖4 超聲時間的影響

圖5 超聲功率的影響

2.6 超聲優(yōu)化正交實驗

由表2 可知，不同因素及水平進行正交試驗，結(jié)果為A3＞A2＞A1，B1＞B2＞B3，C2＞C1＞C3，D3＞D1＞D2，4個因素的優(yōu)水平組合為A3B1C2D3 為本試驗的最有水平組合，L43 由極差分析可得影響黃酮提取率的因素為：時間(A)＞超聲功率(D)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)＞固液比(B)。

表2 沙棘葉黃酮提取正交試驗設(shè)計

續(xù)上表

3 討 論

纖維素酶的功能主要是破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)，釋放出胞內(nèi)物質(zhì)；果膠酶釋放細胞中果膠，果膠對黃酮的吸附性較強，所以在提取黃酮時，添加纖維素酶效果要好于果膠酶。 纖維素酶還有一個作用是不破壞原料的活性成分[7]，對提取率有明顯提高作用[8]。 本試驗在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，添加了纖維素酶。

沙棘葉黃酮的提取方法主要有熱水浸提、有機溶劑提取、微波輔助提取和超聲波提取等方法和工藝(趙芙蓉,2012[9])。 不同提取法相比較，超聲波提取的優(yōu)勢有強化乙醇浸提，達到省時、高效、節(jié)能的目的(Riera,2004[10])。 孫天宇等(2012)[4]研究也驗證了這一觀點，所以本試驗采用超聲波提取法。

在本試驗條件下，從單因素看，75%乙醇濃度時，沙棘黃酮提取率較高。 孫天宇（2012）[4]的研究也論證了這一點，在75%附近提取率較高，但本試驗與孫天宇在75%以后的試驗結(jié)果有差異，本試驗在75%乙醇濃度繼續(xù)增加乙醇濃度，提取率顯著下降，可能是由于增加了酶解等不同的處理方法，導(dǎo)致高濃度乙醇溶液對沙棘中黃酮提取率產(chǎn)生影響，后續(xù)對條件進一步研究。 從料液比來看，不同料液比的提取率呈現(xiàn)類似正態(tài)分布，在1：35 附近達到頂峰，隨之下降，可能是隨著添加的液體增加，物料的濃度降低，從而降低提取率。 隨著超聲功率增加，沙棘黃酮提取率逐漸增加，但在90%時是一個拐點。 超聲強度與提取效率呈正比關(guān)系[11]。 根據(jù)圖5 表明，在50%～90%之間，提取率升高較明顯，在高于90%時提取率略有下降，說明過高的超聲功率對黃酮分子產(chǎn)生破壞作用，沙棘黃酮有所損失。

4 小 結(jié)

利用超聲波提取沙棘葉黃酮，最佳工藝條件為75%乙醇體積分?jǐn)?shù)，1︰35（g/mL）料液比，48 min 超聲時間，95%超聲波功率。