耿繼武，周兆明，山常國，文磊，劉浩，成杰，周美娟，陳龍華，蔡林波，周成

1.廣東省職業(yè)病防治院/廣東省職業(yè)病防治重點實驗室，廣東廣州510300；2.廣東三九腦科醫(yī)院腫瘤綜合治療科，廣東廣州510510；3.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院放射醫(yī)學系，廣東廣州510515；4.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200127；5.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院放療科，廣東廣州510515

前言

質(zhì)子重離子是經(jīng)回旋或同步加速器加速產(chǎn)生的帶電高能粒子射線（1H、12C），是目前國際上最前沿的放射腫瘤治療技術(shù)［1］。相比常規(guī)X線放療而言，質(zhì)子重離子具有獨特的物理劑量空間分布優(yōu)勢（布拉格峰）［2］以及更強的生物學效能與細胞殺傷效應(yīng)，比如增加致死性DNA損傷同時減少對于細胞周期和氧合依賴性［3］。得益于這一重要特性，重離子對常規(guī)放療抵抗與乏氧的腫瘤仍然具有較好的治療效果。在過去20年的臨床實踐中，以碳離子為基礎(chǔ)的重離子放療已經(jīng)取得令人欣喜的療效［4］。在早期非小細胞肺癌中，日本放射線研究所采用重離子放療已從早期的18次分割放療逐步減少到9次、4次甚至單次分割治療即可取得滿意的治療效果［5-7］。

肺是一個放射敏感器官，這一點從廣島、長崎核爆炸幸存者跟蹤研究或核設(shè)施職業(yè)暴露人員出現(xiàn)的肺癌高發(fā)病率已得到充分證實［8-9］。常規(guī)X線引起的放射性肺損傷，已有大量較為深入的研究和闡述［10-12］。但是和世界范圍內(nèi)高線性能量傳遞（LET）射線應(yīng)用不斷推廣相比，高能粒子射線對于正常組織的生物學效應(yīng)及毒副作用研究卻顯得非常缺乏。本研究旨在通過高LET射線輻射誘導小鼠肺組織損傷模型，基于全基因組芯片探討肺組織受重離子輻射后出現(xiàn)的應(yīng)激性轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及潛在的放射敏感基因標志物，從而進一步理解正常組織對高能粒子射線的應(yīng)激反應(yīng)機制并尋找可靠的急性期射線暴露生物標志物。

1 材料與方法

1.1 動物實驗分組及照射劑量

采用8～10周齡C57BL6雌性小鼠，SPF級飼養(yǎng)。照射前經(jīng)異氟烷誘導麻醉后，轉(zhuǎn)移至專用小鼠胸部照射裝置并妥善固定。采用重離子束進行全肺野照射，肺野置于布拉格峰中間，峰值寬度30 mm。實驗動物隨機分為空白對照組（12只）和照射組（12只），照射組予以單次12.5 Gy重離子射線照射；空白對照組不接受照射（0 Gy）。于照射后2、24 h分別采用頸椎脫臼法處死小鼠并提取新鮮肺組織，經(jīng)TRIzol處理后-20℃凍存用于進一步提取mRNA。重離子梯度劑量照射（劑量爬坡）實驗共分為7組，分別接受0、7.5、10.5、12.5、14.5、17.5、20.0 Gy重離子全肺野照射。劑量爬坡實驗于照射后7 d分別采用頸椎脫臼法處死小鼠并提取新鮮肺組織，經(jīng)TRIzol處理后-20℃凍存用于進一步提取mRNA。

1.2 基因芯片及數(shù)據(jù)分析

TRIzol處理肺組織經(jīng)RNeasy Mini Ki（tQiagen）分離提取總RNA。為了避免DNA污染，用DNase I（Qiagen）處理RNA。純化的RNA在45.0 μL無核酸酶的水中洗脫，并置于-20℃儲存。使用NanoDrop ND-1000分光光度計（PEQlab）評估RNA濃度和純度。使用2100Bioanalyzer（Agilent）和相應(yīng)的RNA Nano Chip測定RNA樣品的完整性和純度?；谌蚪M基因表達陣列對樣品進行分析。使用自帶軟件包進行表達矩陣的生成、數(shù)據(jù)注釋和處理。在隨后的統(tǒng)計測試中，對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換以說明基因的表達上升或者下降。mRNA相對表達量的倍數(shù)計算方法：倍數(shù)變化（fold-change）=2-ΔΔCt=2-(ΔCt實驗組-ΔCt對照組)；ΔCt=Ct待測樣品-Ct內(nèi)參（Ct為反應(yīng)管中熒光強度達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。為分析不同時間點輻射與基因表達趨勢關(guān)系，采用Rv3.4.4軟件包進行supervised與non-supervised聚類分析，包括主成分分析、層次聚類、K均值聚類和自組織映射來識別劑量相關(guān)基因表達。敏感基因劑量-效應(yīng)曲線采用非線性回歸擬合分析。

2 結(jié)果

小鼠肺組織經(jīng)重離子12.5 Gy照射后2 h，實驗組相比空白對照組顯著上調(diào)的基因如圖1a所示。其中，Trp53inp1（Tumor Protein P53 Inducible Nuclear Protein 1,腫瘤蛋白 P53誘導核蛋白 1）、Phlda3（Pleckstrin Homology-Like Domain FamilyAMember 3,Pleckstrin同源域家庭成員 3）、Ddit4l（DNA Damage Inducible Transcript 4 Like,DNA損傷誘導型轉(zhuǎn)錄本4樣蛋白）與Gtse1（G2And S-Phase Expressed Protein 1,G2和S期表達蛋白1）4個基因表達最為明顯，平均上調(diào)2.0～2.2倍（圖1b）?；騍esn2（Sestrin 2,Hypoxia-Induced Gene,缺氧誘導基因）與Bbc3（BCL2 Binding Component 3,BCL2結(jié)合成分3）兩者次之，平均上調(diào)幅度約為1.4倍。其他基因如Mdm2（MDM2 Proto-Oncogene,MDM2原癌基因）、Ptp4a1（Protein Tyrosine Phosphatase Type IVA,Member 1,蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型成員1）、Pmaip1（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate Induced Protein 1,PMA誘導蛋白1）以及Osgin1（Oxidative Stress Induced Growth Inhibitor 1,氧化應(yīng)激誘導生長抑制劑1）也均觀察到上調(diào)幅度1.1～1.2倍。

圖1 小鼠肺組織經(jīng)重離子12.5 Gy照射后2 h實驗組相比對照組顯著上調(diào)的基因表達變化情況Fig.1 Up-regulated genes of normal lung tissues at 2 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

上述同一時間點，篩選到的顯著下調(diào)基因如圖2a所示。由圖2可見，照射后2 h顯著下調(diào)的基因相對較少，其中 Wisp2（WNT1 Inducible Signaling Pathway Protein 2,WNT1誘導信號通路蛋白2）與IL33（Interleukin 33,白細胞介素33）基因在照射后2 h明顯下調(diào)（1.2倍左右）（圖 2b）。Dido1（Death Inducer-Obliterator 1,死亡誘導劑-湮滅者1）、Efcab4a（Cracr2b, Calcium Release Activated Channel Regulator 2B,鈣釋放激活通道調(diào)節(jié)器2B）、Myo1f（Myosin IF,肌球蛋白IF）僅出現(xiàn)了0.95、0.68、0.65 倍的下調(diào)。

重離子射線照射后24 h的結(jié)果見圖3a，結(jié)果顯示，Phlda3、Ddit4l基因的平均表達水平相比2 h時間點出現(xiàn)升高，分別達到2.5、2.3倍（圖3b）。而Trp53inp1、Gtse1、Sesn2的表達水平比2 h時間點雖出現(xiàn)略微降低，但仍然保持在較高的表達水平（分別是1.50、1.95、1.10倍）。在24 h這一時間點，還觀察到一批新的上調(diào)基因如Exoc4（Exocyst Complex Component 4,Exocyst復合成分 4）、Ephx1（Epoxide Hydrolase 1,環(huán)氧化物水解酶1）、Thyn1（Thymocyte Nuclear Protein 1,胸腺細胞核蛋白 1）、Ei24（EI24,Autophagy Associated Transmembrane Protein,自噬相關(guān)跨膜蛋白）分別為1.90、1.80、1.45、1.20倍。在照射后24 h，轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)基因相比2 h明顯增多。

圖2 小鼠肺組織經(jīng)重離子12.5 Gy照射后2 h實驗組相比對照組顯著下調(diào)的基因表達變化情況Fig.2 Down-regulated genes of normal lung tissues at 2 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

圖3 小鼠肺組織經(jīng)重離子12.5 Gy照射后24 h實驗組相比對照組顯著上調(diào)的基因表達變化情況Fig.3 Up-regulated genes of normal lung tissues at 24 h after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

其中以 Gpihbp1（Glycosylphosphatidylinositol Anchored High Density Lipoprotein Binding Protein 1,糖基磷脂酰肌醇錨定高密度脂蛋白結(jié)合蛋白1）、Sla（Src Like Adaptor,Src類適配體）、Hist1h3ah（Histone Cluster 1 H3A Family Member H,組蛋白簇1 H3A家族成員H）最為顯著，分別達到1.60、1.40、1.35倍。Cd2與Stc1基因居其次，分別下調(diào)是1.1、0.8倍（圖4）。

圖4 小鼠肺組織經(jīng)重離子12.5 Gy照射后24 h實驗組相比對照組顯著下調(diào)的基因表達變化情況Fig.4 Down-regulated genes of normal lung tissues at 24 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

根據(jù)上述對照射后肺組織應(yīng)激反應(yīng)期2、24 h兩個不同時間點的顯著表達基因進行維恩分析后顯示，Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1與Ddit4l這5個基因的mRNA表達水平有助于提示受高能粒子射線輻射后正常肺組織應(yīng)激反應(yīng)的潛在基因標志物（圖5）。進一步采用重離子梯度劑量照射后7 d的小鼠肺組織進行轉(zhuǎn)錄芯片檢測，結(jié)果表明，由上述5個基因構(gòu)成的基因組合的表達水平隨輻射劑量增加而上調(diào)（圖6a），并經(jīng)非線性回歸分析獲得基于敏感基因平均表達強度的劑量-效應(yīng)曲線、擬合程度良好（圖6b）（adjustedR2=0.60）。

3 討論

肺癌或其他胸部腫瘤放射治療引起的放射性肺炎或肺纖維化一直是臨床較為關(guān)注的問題［13-15］。然而，目前臨床上仍缺乏能夠用來準確提示與評估治療過程中正常組織放射性肺損傷的早期基因標志物。在細胞生物學研究中，當細胞受到各種外界條件刺激（如營養(yǎng)缺乏、射線引起DNA損傷、缺氧、溫度休克等）后，可迅速出現(xiàn)基因表達的改變從而影響一系列的蛋白質(zhì)合成［16］。這一細胞在轉(zhuǎn)錄水平的重要應(yīng)激機制，為我們探索正常組織放射性損傷基因標志物提供了嶄新的思路。盡管小鼠放射性肺損傷模型長期以來在放射生物學與劑量毒副作用研究中被廣泛使用［17］，但這一重要模型在探索高能粒子射線輻射應(yīng)激反應(yīng)生物標志物方面尚屬首次［18-19］。

圖5 維恩圖分析顯示經(jīng)重離子照射后應(yīng)激反應(yīng)期不同時間點（2、24 h）均顯著表達的基因Fig.5 Venn analysis revealed 5 most up-regulated genes at 2 and 24 hours after heavy-ion exposure

本實驗采用重離子短期（2、24 h）照射小鼠肺部，并利用基因芯片進行肺部基因表達水平檢測，篩查出一系列經(jīng)過照射后發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)的基因。這些對重離子照射敏感的基因，是潛在提示受照射后短期內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)激反應(yīng)的基因。此外，Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1與Ddit4l這5個基因的mRNA表達水平在梯度劑量重離子照射7 d后均出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示這些基因與高LET射線輻射后肺組織應(yīng)激反應(yīng)可能存在一定的關(guān)聯(lián)，可作為潛在的轉(zhuǎn)錄水平標志物。今后我們將對這些“潛在標志基因”進行基因表達水平及蛋白表達水平的進一步驗證和分析，以排除統(tǒng)計過程或其他原因引起的誤差。此外，這些早期顯著改變的基因可能與DNA損傷以及修復相關(guān)通路有關(guān)，但是否與后期肺炎、肺纖維化的發(fā)病機制存在一定關(guān)聯(lián)也有待進一步探索。

綜上所述，本研究根據(jù)照射后應(yīng)激反應(yīng)階段的小鼠肺組織進行全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析，發(fā)現(xiàn)照射后2、24 h不同時間點的輻射相關(guān)顯著表達基因，有助提示高能粒子射線照射后的正常肺組織轉(zhuǎn)錄水平改變。此外，發(fā)現(xiàn)Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1與 Ddit4l這5個基因可作為檢測肺組織高LET射線輻射后應(yīng)激反應(yīng)的潛在標志物。這些早期輻射敏感基因與DNA損傷修復、放射性肺炎與纖維化之間是否存在病理生理學關(guān)聯(lián)仍有待進一步研究闡述。

圖6 接受梯度劑量重離子射線照射后7 d急性期敏感基因組合隨重離子劑量升高的表達改變和劑量-效應(yīng)曲線Fig.6 Expression levels and dose-response curves of 5 selected gene-signatures at the 7thday after dose-escalated heavy-ion irradiation