奚惠雨，茅希穎，孫 潔，袁松濤，劉慶淮

0引言

眼睛，作為連接人類與外在世界的窗戶，給予人類分辨外界事物以及顏色的能力。其中視網(wǎng)膜作為整合視覺信息的復(fù)雜神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)，它的損傷往往會導(dǎo)致視力不可逆的損害。在大多數(shù)國家，視網(wǎng)膜退行性病變是導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的重要原因[1]，如視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等[2]，這些疾病會導(dǎo)致感光細(xì)胞功能損傷及數(shù)量減少，引起視力受損，最終導(dǎo)致失明。目前此類疾病的治療方法包括神經(jīng)保護(hù)治療、基因療法、藥物療法、光遺傳學(xué)治療、人工視網(wǎng)膜以及細(xì)胞替代療法等[3]。但是，大多數(shù)治療方法包括已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium cells，RPE)移植的治療目標(biāo)均為保護(hù)殘存的感光細(xì)胞，因此只適用于疾病的早期階段。但針對感光細(xì)胞大部分丟失的疾病晚期階段，迄今為止仍未建立有效的治療方案。如何獲得移植所需的感光細(xì)胞并進(jìn)行有效移植，是治療晚期視網(wǎng)膜退行性疾病的關(guān)鍵問題。本文通過介紹感光細(xì)胞移植的發(fā)展及體外獲得大量人源性感光細(xì)胞的方法，總結(jié)外源性感光細(xì)胞及視網(wǎng)膜組織用于移植治療的主要方法及局限性，以期為視網(wǎng)膜退行性疾病的感光細(xì)胞移植治療提供新思路。

1感光細(xì)胞移植替代治療的發(fā)展

在過去的30余年，視網(wǎng)膜退行性疾病動物模型的感光細(xì)胞移植替代療法的有效性已得到不斷證實(shí)。最早期的感光細(xì)胞移植替代研究主要是小鼠體內(nèi)來源的感光細(xì)胞移植整合效率的研究，包括分別將新生鼠視網(wǎng)膜全層細(xì)胞、感光細(xì)胞層以及感光細(xì)胞懸液移植至視網(wǎng)膜下腔中。20世紀(jì)90年代，Gouras等[4]和Kwan等[5]分別報道了分離新生鼠的感光細(xì)胞懸液并移植至內(nèi)源性感光細(xì)胞幾乎完全消失的視網(wǎng)膜變性鼠模型中。這些研究發(fā)現(xiàn)移植的感光細(xì)胞有新生的外節(jié)段且能與內(nèi)核層細(xì)胞形成突觸連接，并證實(shí)變性的感光細(xì)胞被移植的新細(xì)胞替代后，內(nèi)在的神經(jīng)視網(wǎng)膜可以重新形成視覺信息[6]。有研究將不同發(fā)育階段的小鼠視桿細(xì)胞移植進(jìn)正常及疾病小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)出生后4～6d來源的視桿前體細(xì)胞具有最強(qiáng)的整合能力[7]，而將出生之前的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(retinal progenitor cells，RPCs)進(jìn)行移植發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)出現(xiàn)不可控的分化方向，表現(xiàn)為僅有小部分分化為感光細(xì)胞。因此，具備最佳移植狀態(tài)的感光細(xì)胞應(yīng)為小鼠出生后4～6d的細(xì)胞，因?yàn)檫@個時間點(diǎn)感光細(xì)胞剛剛能夠產(chǎn)生突觸連接。除了細(xì)胞懸液移植外，視網(wǎng)膜全層細(xì)胞及感光細(xì)胞層的移植也得到了不斷研究[8-9]。如將胎鼠細(xì)胞層移植進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔發(fā)現(xiàn)其向RPE層形成外節(jié)段，并且能夠幫助維持光誘發(fā)活動，另有研究將胎兒視網(wǎng)膜層移植于重度ARMD與RP患者中，發(fā)現(xiàn)視覺功能及視力均得到有效改善[10-11]。

盡管體內(nèi)來源的細(xì)胞研究證明了感光細(xì)胞移植的可行性，但由于人供體細(xì)胞通常來源于2～3月齡胎兒，并且存在倫理及細(xì)胞來源不足等問題，因此體外獲得大量可供移植的細(xì)胞成為臨床應(yīng)用的必要前提，而干細(xì)胞體外分化技術(shù)產(chǎn)生的細(xì)胞資源為感光細(xì)胞的移植創(chuàng)造了條件。

2視網(wǎng)膜體外培養(yǎng)技術(shù)的研究

人胚胎干細(xì)胞(hESC)[12]和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)[13]是一類可在體外大量擴(kuò)增并具有分化為三胚層中的不同組織細(xì)胞潛能的重要細(xì)胞。在過去的10a中，隨著干細(xì)胞研究的逐漸深入，眾多實(shí)驗(yàn)室在體外將干細(xì)胞逐步分化出胚胎發(fā)育過程中形成的早期神經(jīng)組織、眼區(qū)、RPCs等，最終分化產(chǎn)生多種細(xì)胞類型[14-15]。在最初的2D培養(yǎng)中，對由hESC形成的胚體添加Wnt/BMP通路抑制劑等，多數(shù)細(xì)胞向神經(jīng)視網(wǎng)膜方向分化[16-18]，并通過添加Notch通路抑制劑產(chǎn)生感光細(xì)胞。然而，分化產(chǎn)生的這些細(xì)胞大多數(shù)為內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞，且?guī)缀鯖]有細(xì)胞表達(dá)成熟感光細(xì)胞標(biāo)志物，如opsins。因此，在后續(xù)培養(yǎng)中，通過補(bǔ)充加入對早期感光細(xì)胞發(fā)育有促進(jìn)作用的視黃酸與?；撬嵋蕴岣弑磉_(dá)有opsins的感光細(xì)胞數(shù)量[19-20]。盡管已證實(shí)將2D培養(yǎng)產(chǎn)生的感光細(xì)胞移植到疾病鼠中可恢復(fù)部分視覺功能[21]，但2D培養(yǎng)所產(chǎn)生的感光細(xì)胞仍缺少分化成熟的能力，尤其是無法形成感光細(xì)胞外節(jié)這一重要結(jié)構(gòu)。其次，2D培養(yǎng)分化產(chǎn)生的視錐和視桿細(xì)胞的數(shù)量及比例與體內(nèi)分化相比仍有很大不同[22]。此外，無論是在2D貼壁培養(yǎng)組織或類胚體(embroynics bodys，EBs)中，都沒有正常的視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞層結(jié)構(gòu)，這也會影響感光細(xì)胞的正常發(fā)育。

為解決上述問題，2011年Sasai和David課題組提出了體外3D視網(wǎng)膜分化的方法。使干細(xì)胞在體外自發(fā)形成符合體內(nèi)發(fā)育規(guī)律，具有生理結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜類器官(organoid)[23-24]。不同實(shí)驗(yàn)室也對類器官分化方法進(jìn)行了優(yōu)化。其中，Zhong等[25]解決了感光細(xì)胞分化的一個重要問題即體外感光細(xì)胞能夠成熟并形成外節(jié)結(jié)構(gòu)，并證實(shí)小部分感光細(xì)胞存在光反應(yīng)，且不斷有實(shí)驗(yàn)室報道在體外分化的感光細(xì)胞有纖毛結(jié)構(gòu)以及早期外節(jié)的產(chǎn)生[26-28]。因此可以證明，與2D培養(yǎng)相比，3D體外培養(yǎng)已能夠分化出視杯細(xì)胞及形成視網(wǎng)膜分層，并且隨著類器官培養(yǎng)時間至數(shù)月時，可以產(chǎn)生多種細(xì)胞類型，包括感光細(xì)胞前體細(xì)胞以及包含外節(jié)的成熟感光細(xì)胞。這對干性ARMD等視網(wǎng)膜退行性疾病中進(jìn)行性萎縮退化的RPE、神經(jīng)視網(wǎng)膜以及脈絡(luò)膜血管的替代治療都十分重要。因此，3D體外培養(yǎng)技術(shù)作為目前主要的細(xì)胞來源手段，對臨床尤其是移植替代治療的應(yīng)用有著十分重要的意義。

此外，隨著體細(xì)胞重編程技術(shù)與基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，我們可以將遺傳性視網(wǎng)膜退行性病變患者的成體細(xì)胞重編程形成iPSC，使之不僅能夠產(chǎn)生重要的臨床研究模型，并能分化為視網(wǎng)膜類器官用于藥物篩選，并為感光細(xì)胞的移植治療提供有效的資源[29]。其中，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在內(nèi)在基因缺陷的修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[30]，使患者的iPSC能夠成為重要的自體移植細(xì)胞來源。且最近研究發(fā)現(xiàn)，RNP CRISPR/Cas9技術(shù)能夠更高效地進(jìn)行基因的編輯并且脫靶效應(yīng)更低，在臨床應(yīng)用中更有意義[31]。因此，與hESC來源的類器官移植相比，自體來源的iPSC分化形成類器官在移植替代治療中最大的優(yōu)勢是減少了移植后的免疫原性。盡管目前這種方法成本非常高，但有研究發(fā)現(xiàn)主要組織相容性復(fù)合體匹配的患者在使用相同的iPSC后，會大大降低移植的成本與分化的可變性[32]。因此，基因編輯后的類器官的產(chǎn)生能夠有助于了解視網(wǎng)膜退行性疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸機(jī)制，從而為治療提供新的思路。

3視網(wǎng)膜類器官在移植替代治療中的方法研究

3.1視網(wǎng)膜類器官的片層移植視網(wǎng)膜發(fā)育至胚胎期8～14wk時大量產(chǎn)生感光細(xì)胞前體細(xì)胞并且出現(xiàn)RPCs增殖以及其它神經(jīng)細(xì)胞，既往研究通常使用這一時期的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行移植[33]。已經(jīng)證實(shí)，視網(wǎng)膜類器官在體外30～70d與體內(nèi)胚胎期8～14wk發(fā)育過程相同，可替代胎兒視網(wǎng)膜片層進(jìn)行移植研究，并且移植進(jìn)的視網(wǎng)膜類器官片層組織的分化成熟與整合也得到了不斷證實(shí)。有研究將不同分化階段的小鼠類器官分割成小片層，并移植進(jìn)入感光細(xì)胞完全缺失的小鼠視網(wǎng)膜下腔中，發(fā)現(xiàn)各個時期的移植組織都不斷分化并產(chǎn)生外核層，且移植片層會在宿主體內(nèi)形成3種形態(tài)，11～17d相對不成熟的移植片層可與宿主形成最佳的突觸連接，且移植物中外核層伴有較少的內(nèi)核層可更好地與宿主內(nèi)核層接觸[34]。雖然在上述研究中可以看到突觸的連接和整合，但移植片層的功能并沒有得到證實(shí)。此外，也有研究將人50～60d視網(wǎng)膜類器官片層移植到裸鼠以及外核層退化的靈長類動物模型中，可以看到臨近宿主內(nèi)核層有玫瑰花結(jié)樣組織形成，且表達(dá)有成熟的感光細(xì)胞標(biāo)志物并出現(xiàn)成熟的外節(jié)。在靈長類動物模型中，可觀察到片層中的感光細(xì)胞與片層和宿主的雙極細(xì)胞之間均存在突觸蛋白表達(dá)，但未能檢測到局部電信號的產(chǎn)生[35-36]。盡管如此，這也證實(shí)了hESC來源的類器官不僅可以形成成熟的感光細(xì)胞，也能與宿主視網(wǎng)膜形成突觸連接，這為臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

上述研究表明通過移植完整或解離的視網(wǎng)膜類器官片層能夠治療感光細(xì)胞退行性疾病，但由于移植的片層細(xì)胞組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)紊亂，移植替代效果目前也并不十分理想。因此，類器官片層移植的應(yīng)用仍需要不斷地探索和優(yōu)化。

3.2視網(wǎng)膜類器官的單純感光細(xì)胞移植體內(nèi)來源的小鼠感光細(xì)胞懸液移植研究證明感光細(xì)胞前體細(xì)胞能夠功能性地整合于退化的視網(wǎng)膜中，故在人類視網(wǎng)膜移植替代的研究中，從類器官中獲得最佳且單純的感光細(xì)胞十分重要。有研究將綠色熒光蛋白(GFP)報告基因敲入干細(xì)胞系并進(jìn)行分化，通過流式技術(shù)分選帶有熒光的細(xì)胞，利用此方法將小鼠類器官的Rhop.GFP+的視桿細(xì)胞分離出，并注射至視桿細(xì)胞缺乏的Gnat1-/-鼠的視網(wǎng)膜下腔中，結(jié)果表明感光細(xì)胞前體細(xì)胞階段的移植更有整合效率，并且移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞產(chǎn)生電生理現(xiàn)象且有感光細(xì)胞外節(jié)形成。此外，整合進(jìn)的細(xì)胞與宿主細(xì)胞有著類似的藥理學(xué)激動劑和拮抗劑反應(yīng)，證明體外衍生的細(xì)胞與天然細(xì)胞具有相似性[37]。但在臨床應(yīng)用中無法使用GFP+的感光細(xì)胞進(jìn)行移植，因此另一種直接獲得單純感光細(xì)胞的方法是通過感光細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行流式技術(shù)分選，如CD73+、CD133+、CD24+、CD15-等。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與鼠類器官分選不同的是單獨(dú)的CD73+無法對人來源的視網(wǎng)膜類器官進(jìn)行有效分選，有研究者發(fā)現(xiàn)CD29/SSEA-1雙陰性結(jié)合或者不結(jié)合CD73+的分選方式雖然產(chǎn)出的細(xì)胞總量較低，但可以獲得更大比例的感光細(xì)胞[38]。

盡管人來源的視網(wǎng)膜類器官可以為移植替代治療提供豐富的細(xì)胞資源，但目前人源性類器官的單純感光細(xì)胞移植的效果還未得到更多證實(shí)。這可能與感光細(xì)胞表面標(biāo)志物特異性差，GFP敲入細(xì)胞系難構(gòu)建以及分化出的視錐細(xì)胞比例低有關(guān)。因此，如何有效地在早期獲得成熟的、大量的可供移植的感光細(xì)胞仍是目前需要解決的問題。

4視網(wǎng)膜類器官的優(yōu)勢與局限

目前，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的視網(wǎng)膜體外分化技術(shù)涵蓋了視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的細(xì)胞與分子層面上的主要特征[39]。類器官的應(yīng)用不僅在于能為視網(wǎng)膜退行性疾病的細(xì)胞移植治療提供豐富的組織資源，且與其它技術(shù)的結(jié)合與利用也能夠幫助了解視網(wǎng)膜正常發(fā)育以及變性過程，建立疾病模型，測試藥物治療功效等[40-41]。而且疾病應(yīng)用模型與藥物測試相結(jié)合也為精準(zhǔn)醫(yī)療帶來了可能性，如誘導(dǎo)復(fù)雜遺傳性疾病的患者iPSC分化產(chǎn)生特異的類器官以定制個性化治療方案等。

但是，視網(wǎng)膜類器官在分化與移植方面仍存在問題：(1)盡管不同實(shí)驗(yàn)室對3D培養(yǎng)技術(shù)下由干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜類器官進(jìn)行了不斷優(yōu)化，但目前的培養(yǎng)技術(shù)仍有一定的局限性。如在長期培養(yǎng)中獲得的已經(jīng)分化成熟的類器官的結(jié)構(gòu)仍有很高的變異性，從而影響數(shù)據(jù)信息的穩(wěn)定[42]，因此通過改進(jìn)現(xiàn)行的3D培養(yǎng)技術(shù)以提高長期培養(yǎng)中類器官的穩(wěn)定性顯得尤為重要。(2)雖然在類器官中能夠發(fā)現(xiàn)雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞和Müller膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的標(biāo)志物，但正確的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型比例仍未形成，尤其是位于內(nèi)核層中的細(xì)胞。(3)由于視網(wǎng)膜類器官與胎兒體內(nèi)視網(wǎng)膜分化的時間大致相同，即體外視網(wǎng)膜分化成熟與獲得通常所需數(shù)月時間，這也大大增加了視網(wǎng)膜疾病治療以及獲得移植資源的時間。因此，有效縮短培養(yǎng)獲得類器官的時間也是十分必要的，但分化時間的縮短有可能會引起細(xì)胞分化命運(yùn)的改變。(4)盡管已經(jīng)有研究將干細(xì)胞分化產(chǎn)生的視錐細(xì)胞移植進(jìn)晚期階段的RP模型中證明了視錐細(xì)胞移植的可行性[43]，且有研究分別對胎兒及干細(xì)胞來源的視錐細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了分析[44]，但目前的視網(wǎng)膜類器官仍無法產(chǎn)生與分離大量人類高敏視力所需要的視錐細(xì)胞，尤其是L/M型視錐細(xì)胞。因此，視錐細(xì)胞定向分化以及純化的方法仍需要進(jìn)一步研究。

5展望

目前，為解決分化中的問題，3D培養(yǎng)方法已在不斷改進(jìn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺氧和生物反應(yīng)器的使用能促進(jìn)感光細(xì)胞的產(chǎn)生[45]，但臨床試驗(yàn)的應(yīng)用仍需要3D分化方法的進(jìn)一步優(yōu)化，以維持類器官功能的穩(wěn)定和量化分析產(chǎn)生的感光細(xì)胞的純度、活力及發(fā)育階段。再者，移植細(xì)胞的安全性仍然需要得到有效評估，因?yàn)槲捶只母杉?xì)胞及有增殖能力的細(xì)胞群會導(dǎo)致腫瘤組織的形成[46]。因此，在移植前有效地移除這些細(xì)胞，不僅能夠減少腫瘤發(fā)生的風(fēng)險，更重要的是能提高感光細(xì)胞的整合效率。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)移植進(jìn)的感光細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間可以發(fā)生蛋白質(zhì)與核糖核酸(RNA)的物質(zhì)交換[47]，但與直接的物理整合不同的是，移植細(xì)胞與宿主細(xì)胞間的“物質(zhì)交換”，可以看作是在功能上更新受損的神經(jīng)元。因?yàn)檫@種交換首先需要宿主中仍有殘存的感光細(xì)胞，其次移植細(xì)胞仍然依賴宿主細(xì)胞的突觸連接，因此這種交換并不是功能上的整合。盡管目前細(xì)胞之間的物質(zhì)交換機(jī)制仍不清楚，但是可以猜想移植細(xì)胞的整合現(xiàn)象不僅僅是與宿主細(xì)胞的物理整合有關(guān)，也許與這種物質(zhì)交換也有關(guān)[48]，因此感光細(xì)胞移植治療的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。此外，這種靶向性地細(xì)胞間的融合可能產(chǎn)生一種新的治療方式，例如可將體內(nèi)Müller膠質(zhì)細(xì)胞重編程產(chǎn)生感光細(xì)胞前體細(xì)胞，進(jìn)而分化為感光細(xì)胞，這可能會對現(xiàn)有移植方法提供新的啟示。

總之，人類體外視網(wǎng)膜3D培養(yǎng)產(chǎn)生類器官作為一種新興且快速發(fā)展的技術(shù)，不僅為臨床移植替代治療的應(yīng)用提供了新的思路與前景，也充滿著許多未知的挑戰(zhàn)與可能。而這些問題與挑戰(zhàn)的不斷解決，為視網(wǎng)膜退行性疾病的治療提供了光明的前景。