趙麗霞 張新新 劉浩 陳賽娟 高曉磊 吳雅清 朱秀同 趙玉龍

1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司

2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所

雞毒支原體病是由雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）引起的一種以呼吸道感染和氣囊炎為主要癥狀的慢性呼吸道疾病，可以通過(guò)水平和垂直兩種方式傳播，且常繼發(fā)或并發(fā)新城疫、傳染性支氣管炎、大腸桿菌病等傳染病，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，目前疫苗免疫是防控該疾病的主要措施。

雞毒支原體活疫苗可以最大限度地降低支原體引起的產(chǎn)蛋損失，并取代多種日齡蛋雞同場(chǎng)飼養(yǎng)的雞場(chǎng)中的支原體野毒株，不僅能有效地預(yù)防產(chǎn)蛋損失，而且能防止野毒株在雞群中的定植，因此，雞毒支原體活疫苗免疫接種在禽業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。本文就市場(chǎng)在售的4種雞毒支原體活疫苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，通過(guò)CCU測(cè)定和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行初步評(píng)估，為市場(chǎng)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

一、材料

1.疫苗：購(gòu)自國(guó)內(nèi)不同廠家的雞毒支原體活疫苗（F36株）3家，進(jìn)口疫苗1家，分別標(biāo)記疫苗A、B、C、D。

2.培養(yǎng)基：CM2培養(yǎng)基，配制方法參照中國(guó)獸藥典2015版。

3.SPF雞：購(gòu)自斯派福瑞SPF雞。

4.SPF雞飼養(yǎng)隔離器：瑞普公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、方法

1.活菌滴度測(cè)定。按照疫苗說(shuō)明書對(duì)疫苗進(jìn)行復(fù)溶，每100羽份疫苗加3.0 mL CM2培養(yǎng)基稀釋后，用于活菌滴度測(cè)定。

（1）CCU測(cè)定：取10支內(nèi)裝1.8 ml CM2培養(yǎng)基的圓底試管，在第1管中加入0.2 ml稀釋好的疫苗，充分震蕩混勻后從第1管中吸出0.2 ml加入第2管，做10倍系列稀釋，直至第12管；另取1管裝有2.0 ml的CM2培養(yǎng)基做為陰性對(duì)照。放置生化培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，10 d后進(jìn)行結(jié)果判定，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色（pH值下降≥0.5）的最后一稀釋管作為CCU測(cè)定的結(jié)果。每種疫苗做3個(gè)平行，取最低的CCU值為最終測(cè)定結(jié)果。

（2）CCU50測(cè)定：方法類CCU測(cè)定，取稀釋好的疫苗0.2 ml至裝有1.8 ml CM2培養(yǎng)基的圓底試管中做10倍系列稀釋至10-11，再分別從10-7、10-8、10-9、10-10、10-11管中各取 0.2 ml加入至裝有 1.8 mlCM2培養(yǎng)基的小管中，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)，放置生化培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)。每日觀察培養(yǎng)基顏色變化情況，10 d后進(jìn)行結(jié)果判定，統(tǒng)計(jì)每個(gè)稀釋度培養(yǎng)基顏色變化（pH值下降≥0.5）的小管數(shù)，按照Reed Muench法計(jì)算半數(shù)變化單位（CCU50）。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

（1）安全檢驗(yàn)：每種疫苗按10羽份/只，免疫7日齡SPF雞，10只/組，觀察14 d。免疫前與免疫后14 d剖檢前逐只稱重，記錄體重及剖檢時(shí)氣囊癥狀。每種疫苗免疫組雞單獨(dú)放置一臺(tái)隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

（2）效力檢驗(yàn)：每種疫苗按1羽份/只，免疫7日齡SPF雞，8只/組，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（6只SPF雞免疫滅菌生理鹽水），免疫5周后進(jìn)行MG R株強(qiáng)毒的氣溶膠攻毒；攻毒后14 d剖檢，觀察氣囊病變，并進(jìn)行病變記分，記分標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)獸藥典2015版。每種疫苗免疫組雞單獨(dú)放置一臺(tái)隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

三、結(jié)果

1.活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。

進(jìn)口疫苗D的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果最高，比國(guó)產(chǎn)苗高約2個(gè)滴度。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（1）安全檢驗(yàn)：各組疫苗免疫雞只均無(wú)明顯臨床癥狀，剖檢時(shí)氣囊均無(wú)病理?yè)p傷。10倍劑量免疫后，其中疫苗C組的雞只日增重量最大，對(duì)雞生長(zhǎng)影響最小。增重實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

（2）效力檢驗(yàn)：攻毒后從第8天起，陰性對(duì)照組雞只開始出現(xiàn)啰音，疫苗免疫組均無(wú)啰音癥狀出現(xiàn)；兩周后剖檢，記錄氣囊發(fā)病情況，對(duì)照組有5只雞的氣囊出現(xiàn)2分以上的病變，實(shí)驗(yàn)成立。計(jì)算每組的平均氣囊保護(hù)率，其中進(jìn)口疫苗D的攻毒保護(hù)率為62.5%，在4組中最低。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 各組疫苗活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

表2 各組疫苗對(duì)免疫雞增重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 各組疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

四、討論

通過(guò)CCU及CCU50的測(cè)定，3種國(guó)產(chǎn)雞毒支原體活疫苗（F36株）均低于進(jìn)口疫苗，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在抵抗強(qiáng)毒攻擊方面進(jìn)口疫苗明顯遜于國(guó)產(chǎn)苗。雞毒支原體活疫苗（F36株）能有效的抵抗強(qiáng)毒的攻擊，但不同廠家的疫苗對(duì)雞只的增重影響有差異，綜合評(píng)價(jià)，疫苗C的質(zhì)量最優(yōu)。

5-30日齡是雛雞最容易感染雞毒支原體的日齡，雞毒支原體感染對(duì)雛雞造成的危害比成雞嚴(yán)重得多，早期免疫接種非常重要，雞毒支原體引起的氣囊病變大多是不可逆的，早期感染給后期康復(fù)帶來(lái)長(zhǎng)期的不利影響。用雞毒支原體F株接種的雞可有效預(yù)防野毒的感染，弱毒F株能逐步取代雞場(chǎng)中的野毒，從而達(dá)到清除野毒支原體的目的。因此，為了預(yù)防雞毒支原體的早期感染，對(duì)小日齡雛雞接種雞毒支原體F株活疫苗非常必要。