薦紅舉 楊 博 李陽陽 楊 鴻 劉列釗 徐新福 李加納

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甘藍型油菜基因家族的鑒定與表達分析

薦紅舉**楊 博**李陽陽 楊 鴻 劉列釗 徐新福 李加納*

西南大學農學與生物科技學院 / 油菜工程研究中心 / 西南大學現(xiàn)代農業(yè)科學研究院, 重慶 400716

植物磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)基因對于控制開花時間具有重要作用。油菜作為世界上最重要的油料作物之一, 與模式植物擬南芥具有相似的開花習性。但有關油菜開花基因的功能研究相對較少。本研究利用擬南芥PEBP基因家族蛋白序列在油菜基因組內進行BlastP分析, 獲得油菜PEBP家族成員, 并對其進行基因結構分析、motif預測、復制事件、進化樹構建、選擇壓力分析和組織表達分析。結果表明, 共有26個油菜基因成員得到鑒定, 大部分成員含有4個外顯子和3個內含子, motif-1和motif -2是PEBP成員的特征基序, 超過76.9%的成員屬于片段復制擴增事件。進化樹分析顯示, PEBP分為3個亞家族, 基于轉錄組測序的組織表達數(shù)據(jù)表明油菜26個成員具有非常明顯的組織表達特性。以上研究結果, 極大豐富了我們對甘藍型油菜開花基因及調控模式的認識, 為進一步的分子育種提供了理論基礎。

油菜; 開花基因; PEBP; 進化; 表達

開花是植物通過有性生殖傳遞后代的關鍵前提, 開花時間是影響作物產量和品質最重要的農藝性狀之一。相比于其他性狀, 開花時間對外界環(huán)境更加敏感。因此, 控制開花時間對于提高不同地域的作物產量具有重要意義。截至目前, 有關開花候選基因的解析主要集中在擬南芥等模式植物中。在擬南芥中, 超過300個開花基因得到鑒定[1], 這些基因根據(jù)其參與的過程主要分為六大途徑, 即春化過程、光周期途徑、外界溫度、赤霉素途徑、自發(fā)途徑和內在因素[2-4]。雖然不同的基因參與不同的開花調控通路, 但各通路被幾個關鍵基因協(xié)同調控, 如()、()、()和()[5]。

FT基因編碼一個稱為“促花素”的可以長距離移動的信號蛋白, 在開花調控中起著核心調控作用[6]。該基因屬于植物磷脂酰乙醇胺結合蛋白PEBP (phosphatidylethanolamine-binding protein)基因, PEBP基因編碼蛋白包含一個保守結構域(InterPro: IPR00891)。進化研究表明, 該蛋白家族分為3個亞家族, 即FT、TFL1 (TERMINAL FLOWER 1)和MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)。其中, FT主要是誘導開花, TFL1抑制開花, 而MFT主要參與種子發(fā)育和萌發(fā)過程[7-9]。在擬南芥中,家族包含6個基因成員, 即、、()、()、()和[10]。其中,、和促進開花,、和抑制開花[11-13]。在擬南芥中, 2個基因,和是開花激活因子, 突變該基因將延遲開花[11,14]。在長日照環(huán)境中,和在葉子韌皮部的伴胞細胞中上調表達[15]。作為的旁系同源基因,在營養(yǎng)生長期的成熟頂端分生組織的內表皮中少量積累, 而開花之后, 其表達量顯著下調[16-17]。TFL1蛋白是一個移動信號, 可從頂端分生組織的內表皮移動到外表皮[18]。雖然和在序列上非常相似, 都可以與FD (FLOWERING LOCUS D)互作來調控FD依賴的靶基因, 但在調控開花過程中的作用是相反的[19]。在高鹽脅迫中, BFT可以通過調節(jié)光周期來適應外界脅迫[20]。MFT特異誘導下胚軸和根的轉變, 其突變體表現(xiàn)為在種子萌發(fā)過程中對ABA的超敏反應, 而且在萌發(fā)的種子中,的表達直接受到ABA-INSENSITIVE3 (ABI3)和ABI5的調控, 同時, MFT通過反饋抑制ABI5的表達來促進胚的發(fā)育[21]。

相比于單個基因成員的研究, 在植物基因組范圍內對的鑒定愈發(fā)重要且普遍家族相對較少。比如, 在大豆中有23個成員得到鑒定, 幾乎是擬南芥基因數(shù)目的4倍[22], 其中GmFT2a和GmFT5a通過調控光周期途徑來控制開花[23]。在單子葉模式植物水稻中, 有19個家族得到鑒定, 其中()和()被研究的最為透徹[24]。在短日照環(huán)境中, Hd3a促進水稻開花, 而的同源基因主要在被抑制時起到控制開花的功能[25]。在玉米的24個家族中, 只有跟擬南芥的功能最為相似[26]。

油菜, 作為世界上最重要的油料作物之一, 與模式植物擬南芥具有相似的開花習性。雖然有很多通過基因定位和高通量測序技術研究油菜開花基因或通路的報道, 但是穩(wěn)定的QTL或者關鍵調控基因或因子尚未得到解析[27-28]。相比于QTL定位方法篩選候選基因, 以擬南芥基因功能作為參考, 并結合RNA-Seq和分子實驗來篩選并鑒定開花相關基因, 然后通過全基因組比較分析作物開花候選基因是非常方便和準確的。這種方式已經在蘿卜中得到運用[29]。通過這種方式還可以為進一步的功能鑒定以及開花通路調控因子提供候選基因。家族成員的進化分析在大豆、棉花、郁金香和小麥等作物中已有報道[10,29-32], 但油菜中尚無有關該基因家族的鑒定、進化和表達分析。本研究利用擬南芥PEBP家族成員的蛋白序列為參考, 通過BlastP方式, 獲得甘藍型油菜以及親本種白菜和甘藍的PEBP家族成員, 并分析其進化、選擇壓力以及組織表達, 可為油菜開花性狀候選基因的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 序列的獲得

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)中獲取擬南芥基因的蛋白序列, 并以此序列在BRAD數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org/brad/index. php)中進行BlastP, 閾值E<10–5, 篩選甘藍型油菜、白菜和甘藍的同源基因, 并下載相應蛋白和CDS序列。

1.2 油菜PEBP基因結構、motif預測以及重復基因檢測

根據(jù)油菜基因家族的基因組DNA及CDS序列, 并利用在線工具GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu. cn/)分析其基因結構。利用在線工具MEME (http:// meme-suite.org/)預測油菜基因家族的保守結構元件, 并設置motifs數(shù)量為5個, 寬度為6~50?；蚪Y構和motif結果均利用TBtools工具展示。用軟件MCScanX 分析26個油菜基因家族的復制情況, 默認其參數(shù)。

1.3 序列比對及進化分析

利用Clustal W軟件對獲取的擬南芥、甘藍型油菜、白菜和甘藍基因組內的PEBP的序列進行完全比對。用MEGA 6.0軟件, 通過鄰接法(Neighbor Joining, NJ)構建基因分子進化樹, 設BootStrap抽樣次數(shù)為1000, 默認其余參數(shù), 并用軟件Figtree展示。

1.4 選擇壓力分析

用MEGA 6.0內置的Muscle對擬南芥和甘藍型油菜之間的共線性基因對做codon比對[33], 然后用軟件KaKs_Calculator 2.0計算共線性基因之間的選擇壓力[34]。

1.5 甘藍型油菜PEBP家族成員的組織表達分析

利用課題組前期完成的不同發(fā)育時期的‘中雙11’共111個組織器官的轉錄組數(shù)據(jù)(PRJNA358784)分析甘藍型油菜的表達情況, 樣品詳細信息見附表1。對各成員的表達量取log2FPKM后利用MeV 4.9.0 (http://en.bio-soft.net/chip/MeV.html)繪制熱圖展示。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜、白菜和甘藍PEBP基因家族成員篩選

為篩選并鑒定甘藍型油菜及親本種白菜和甘藍基因組內基因成員, 利用擬南芥的6個PEBP蛋白序列在BRAD網站上進行BlastP分析(E<10–5), 分別獲得26、12和11個甘藍型油菜、白菜和甘藍基因成員(表1)。值得一提的是, 在甘藍基因組內沒有發(fā)現(xiàn)亞家族同源基因, 可能在進化過程中被丟失。

表1 利用BlastP方法獲得油菜、白菜、甘藍和擬南芥PEBP同源基因

2.2 基因結構與motif預測

基因結構決定其功能, 為進一步分析油菜基因家族的功能, 利用其CDS和基因組DNA序列分析其外顯子-內含子結構, 并按照其進化樹順序展示(圖1)。除了()和()含有3個外顯子和2個內含子之外, 其余基因家族成員均含有4個外顯子和3個內含子。Motif預測結果表明, Motif-1和Motif-2是基因家族的特征性motif, 除()和()只含有Motif-1和Motif-2外, 其余成員還含有Motif-3、Motif-4和Motif-5, 說明Motif-3、Motif-4和Motif-5的功能也相當保守(圖2)。

圖1 油菜PEBP進化樹與基因結構

圖2 油菜PEBP基因家族motif預測

為檢測油菜基因家族的擴增情況, 檢測了26個成員復制情況, 發(fā)現(xiàn)超過76.9%的成員都屬于片段重復, 說明片段復制在油菜家族擴增中起著重要作用。

2.3 序列比對與進化樹構建

利用Clustal W軟件將4個物種PEBP蛋白序列進行多序列比對, 并導入DNAMAN中展示(圖3)。用MEGA6.0軟件, 通過鄰接法(Neighbor Joining, NJ) 構建基因分子進化樹(圖4), 表明該基因可分為3個亞家族, 第一亞家族包括ATC(13)和TFL1(11), 第二亞家族包括FT(6)和TSF(6), 第三亞家族包括BFT(5)和MFT(8)。

圖3 油菜與擬南芥PEBP蛋白序列多重比對

2.4 選擇壓力分析

在進化分析中, 常用Ka/Ks或dN/dS來計算某基因是否受到自然選擇作用。如果Ka/Ks>1, 認為有正選擇效應; 如果Ka/Ks=1, 認為存在中性選擇; 如果Ka/Ks<1, 則認為有純化選擇作用。以擬南芥家族基因為參照估算進化過程中甘藍型油菜基因家族的選擇壓力(表2)。表明, 油菜基因家族的Ka/Ks均小于1, 即受到純化選擇, 其中和亞家族的Ka/Ks較大,和亞家族的Ka/Ks較小, 表明和亞家族進化更保守。

2.5 甘藍型油菜PEBP基因家族成員的組織表達分析

為解析甘藍型油菜基因家族的功能, 利用本課題組前期完成的不同發(fā)育時期的中雙11材料的共111個組織器官的轉錄組數(shù)據(jù)分析甘藍型油菜基因家族的表達情況(圖5)。3個基因成員中,在各組織器官中表達量均較低或者不表達, 其余兩個成員在開花后莖稈、葉片和發(fā)育的角果皮中具有較高的表達量, 其他組織器官表達量均較低; 4個成員中, 除在花器官中具有一定表達之外, 其他成員在所有檢測樣品中幾乎均不表達; 4個成員中,和在莖稈、葉片、蕾、雄蕊、花藥、花絲以及不同發(fā)育時期的種子中有一定表達, 其余樣品表達量均較低, 剩余2個成員在所有檢測樣品中幾乎均不表達; 8個油菜成員中, 除了和在胚根和下胚軸中有表達之外, 其余成員均不表達; 2個BFT中,在不同發(fā)育時期的葉子中表達, 其余組織器官中不表達,在所有檢測的樣品中均不表達或者表達量很低; 4個成員均在發(fā)育的種子、種胚、胚芽和種皮中特異表達, 其他組織器官中不表達。以上結果表明, 油菜家族具有較高的組織表達特性, 部分同源基因功能可能發(fā)生分化。

圖4 油菜、白菜、甘藍和擬南芥PEBP基因家族進化分析

表2 油菜和擬南芥PEBP同源基因的Ka/Ks

圖5 油菜PEBP家族成員的組織表達分析

橫坐標樣品名稱詳見附表1, 藍色表示低表達, 黃色表示高表達。

Samples were listed in Supplementary table 1. Blue shows low expression levels and yellow shows high expression levels.

3 討論

隨著白菜、甘藍和甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)的釋放, 蕓薹屬植物的遺傳和分子功能研究進入一個新的時代。有關油菜產量性狀如千粒重、農藝性狀如株高以及抗性性狀如核盤菌抗性的研究已經有大量報道, 而且利用分子標記技術對開花時間等數(shù)量性狀QTL的定位同樣有很多研究。PEBP家族功能非常保守而且在動植物中參與多種生物學過程[35]。其家族成員的功能在擬南芥、水稻、葡萄等作物中有一定研究, 但油菜中除一例報道外[36], 對該基因家族的功能特點研究相對較少。

基于同源比對的方法, 我們在油菜基因組內篩選出26個基因家族成員, 分別包括2個、8個、3個、4個、5個和4個。進化樹表明, 共包含3個亞家族, 其中ATC和TFL1亞家族, 為開花抑制因子; FT和TSF亞家族, 為開花促進因子; BFT和MFT屬于第三亞家族。結構分析表明, 大分部成員含有4個外顯子和3個內含子, 表明油菜基因家族進化非常保守。Motif預測表明Motif-1和-2是PEBP基因家族特征性基序。和亞家族的Ka/Ks較大,和亞家族的Ka/Ks較小, 表明和亞家族進化更保守。

家族成員的組織器官時空表達特性在擬南芥、葡萄和水稻等作物中已有報道[37-39]。但油菜中尚無有該基因的組織表達特性的研究。在本研究中, 3個基因成員除在各組織器官中表達量均較低或者不表達, 其余兩個成員在開花后器官如莖稈、葉片和發(fā)育的角果皮中具有較高的表達量, 其他組織器官中表達量均較低, 這與擬南芥中的表達模式一致[40]。4個成員中, 只有在花器官中具有一定表達, 其他成員均不表達, 而棉花和主要在根中特異表達[30]。作為開花抑制因子, 油菜基因僅在子葉和萌發(fā)的根中表達, 這與擬南芥基因的表達模式一致。5個基因成員中, 只有在花器官中有表達, 而其他成員均不表達, 表明為的主要關鍵成員, 該基因與功能類似, 都抑制植物開花[41]。與TFL1有功能冗余的2個油菜基因, 只有在不同發(fā)育時期的葉子中表達[42]?；蛑饕诜N子中表達, 且對ABA有響應[21], 油菜的4個基因成員在不同發(fā)育時期的種子中均有較高水平表達。

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附表1 ‘中雙11’的111個樣品信息

Supplementarey table 1 Information of 111 materiels from ‘Zhongshuang 11’

編號Code生育期Growth stage器官Organ取樣時間Treatment time編號Code生育期Growth stage器官Organ取樣時間Treatment time Ro_24h種子萌發(fā)胚根萌發(fā)后24 hSe_7d青莢期種子花后7 d Ro_48h種子萌發(fā)胚根萌發(fā)后48 hSe_10d青莢期種子花后10 d Ro_72h種子萌發(fā)胚根萌發(fā)后72 hSe_13d青莢期種子花后13 d Hy_24h種子萌發(fā)下胚軸萌發(fā)后24 hSe_19d青莢期種子花后19 d Hy_48h種子萌發(fā)下胚軸萌發(fā)后48 hSe_21d青莢期種子花后21 d Hy_72h種子萌發(fā)下胚軸萌發(fā)后72 hSe_24d青莢期種子花后24 d Co_24h種子萌發(fā)子葉萌發(fā)后24 hSe_27d青莢期種子花后27 d Co_48h種子萌發(fā)子葉萌發(fā)后48 hSe_30d青莢期種子花后30 d Co_72h種子萌發(fā)子葉萌發(fā)后72 hSe_35d青莢期種子花后35 d GS_12h種子萌發(fā)整個種子萌發(fā)后12 hSe_40d青莢期種子花后40 d GS_24h種子萌發(fā)整個種子萌發(fā)后24 hSe_43d青莢期種子花后43 d Ro_s苗期-溫室根Se_46d青莢期種子花后46 d Ro_s_f苗期-大田根Se_49d青莢期種子花后49 d Ro_b蕾期根Em_19d青莢期種胚花后19 d Ro_i初花期根Em_21d青莢期種胚花后21 d Ro_f盛花期根Em_24d青莢期種胚花后24 d St_b蕾期莖稈Em_27d青莢期種胚花后27 d St_i初花期莖稈Em_30d青莢期種胚花后30 d St_f盛花期莖稈Em_35d青莢期種胚花后35 d St_24d青莢期莖稈花后24 dEm_40d成熟期種胚花后40 d St_50d成熟期莖稈花后50 dEm_43d成熟期種胚花后43 d Le_s苗期-溫室葉片Em_46d成熟期種胚花后46 d Le_s_f苗期-大田葉片Em_49d成熟期種胚花后49 d LeY_b蕾期幼葉Ra_40d成熟期胚芽花后40 d LeY_i初花期幼葉Ra_43d成熟期胚芽花后43 d LeY_f盛花期幼葉Ra_46d成熟期胚芽花后46 d LeY_10d青莢期幼葉花后10 dRa_49d成熟期胚芽花后49 d LeY_24d青莢期幼葉花后24 dSC_19d青莢期種皮花后19 d LeY_30d青莢期幼葉花后30 dSC_21d青莢期種皮花后21 d LeO_b蕾期成熟葉片SC_27d青莢期種皮花后27 d LeO_i初花期成熟葉片SC_30d青莢期種皮花后30 d LeO_f盛花期成熟葉片SC_35d青莢期種皮花后35 d LeO_10d青莢期成熟葉片花后10 dSC_40d青莢期種皮花后40 d LeO_24d青莢期成熟葉片花后24 dSC_43d成熟期種皮花后43 d LeO_30d青莢期成熟葉片花后30 dEn_21d青莢期內種皮花后21 d Bu_b蕾期蕾En_24d青莢期內種皮花后24 d Ao_i初花期花柄Ep_24d青莢期外種皮花后24 d Ao_f盛花期花柄Ep_30d青莢期外種皮花后30 d Cal_i初花期萼片F(xiàn)u_27d青莢期珠柄花后27 d Cal_f盛花期萼片F(xiàn)u_35d青莢期珠柄花后35 d Pe_i初花期花瓣SP_3d青莢期角果皮花后3 d Pe_f盛花期花瓣SP_5d青莢期角果皮花后3 d Pi_f_un盛花期雌蕊-未授粉SP_7d青莢期角果皮花后7 d Pi_i初花期雌蕊SP_10d青莢期角果皮花后10 d

(續(xù)附表1)

編號Code生育期Growth stage器官Organ取樣時間Treatment time編號Code生育期Growth stage器官Organ取樣時間Treatment time Pi_f盛花期雌蕊SP_13d青莢期角果皮花后13 d Sta_i初花期雄蕊SP_16d青莢期角果皮 Sta_f盛花期雄蕊SP_19d青莢期角果皮花后19 d At_i初花期花藥SP_21d青莢期角果皮花后21 d At_f盛花期花藥SP_24d青莢期角果皮花后24 d Cap_i初花期花絲SP_27d青莢期角果皮花后27 d Cap_f盛花期花絲SP_30d青莢期角果皮花后30 d IT_b蕾期主序頂端SP_35d青莢期角果皮花后35 d IT_i初花期主序頂端SP_40d成熟期角果皮花后40 d IT_f盛花期主序頂端SP_43d成熟期角果皮花后43 d Se_3d青莢期種子花后3 dSP_46d成熟期角果皮花后46 d Se_5d青莢期種子花后3 d

Identification and expression analysis ofgene family in oilseed rape

JIAN Hong-Ju**, YANG Bo**, LI Yang-Yang, YANG Hong, LIU Lie-Zhao, XU Xin-Fu, and LI Jia-Na*

College of Agronomy and Biotechnology / Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed / Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

The plant phosphatidylethanolamine-binding protein (PEBP) genes play an important role in controlling flowering time. Rapeseed, as one of the most important oil crops in the world, has similar flowering habits with. In this study, the PEBP family protein sequences ofwere used to perform BlastP analysis in the rapeseed genome. The members of the rape PEBP family were obtained, and the gene structure analysis, motif prediction, duplication analysis, phylogenetic tree construction, selective pressure analysis and tissue expression analysis were carried out on the family members. A total of 26 rapeseed PEBP gene members were identified, and most of them contained four exons and three introns, and motif-1 and motif-2 were the characteristics of PEBP members. Over 76.9% members were segmental duplicated. Phylogenetic tree analysis showed that PEBP was divided into three subfamilies. The tissue-specifics analysis based on RNA-Seq data showed that 26 PEBP members of rapeseed had very obvious tissue expression characteristics. All these results greatly enrich our understandings of flowering genes and regulation patterns in, and provide a theoretical basis for further molecular breeding in.

; flowering genes; PEBP; evolution analysis; expression analysis

2018-07-09;

2018-10-08;

2018-11-01.

10.3724/SP.J.1006.2019.84095

李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250642

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

薦紅舉, E-mail: jianhongju1989@126.com, 楊博, E-mail: sheepneck@hotmail.com

本研究由高等學校學科創(chuàng)新引智基地項目“作物種質資源利用創(chuàng)新引智基地”(B12006), 重慶市民生工程主題專項項目(cstc2016shms- ztzx80020)和重慶市研究生創(chuàng)新項目(CYS17078)資助。

This study was supported by the Project of Intellectual Base for Discipline Innovation in Colleges and Universities (B12006), the Special Project of Chongqing People’s Livelihood, and Chongqing Graduate Student Research Innovation Project (CYS17078).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181030.1734.008.html