王曉瓊， 趙陽國(guó)， 張彥超， 王君鵬， 鄭冰冰， 陳乙平

(中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

隨著近年來海水養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，中國(guó)已成為世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，2014年海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到1 813萬t[1]。然而，海水養(yǎng)殖過程存在嚴(yán)重的自身污染，投喂殘餌、代謝產(chǎn)物及排泄物等向海洋環(huán)境輸出大量的營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷，造成養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化。其中，養(yǎng)殖環(huán)境中的硫化物是伴隨著餌料殘?jiān)锝到?、氧氣過度消耗而產(chǎn)生的主要污染物之一[2]，由于其強(qiáng)烈的生物毒性，對(duì)養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴(yán)重危害，已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵問題。

硫化物的修復(fù)方法主要包括物理、化學(xué)及生物方法，其中物理方法如吹脫、曝氣及顆?；钚蕴课降萚3]，具有設(shè)備簡(jiǎn)易、操作便捷的優(yōu)點(diǎn)，然而該方法存在效率低、不能持久且易反復(fù)等問題；化學(xué)控制如化學(xué)氧化法[4]及化學(xué)沉淀法[5]等，化學(xué)方法去除硫化物速度快，但治理費(fèi)用較高且易對(duì)環(huán)境造成二次污染。相對(duì)于物理化學(xué)方法，硫化物的生物控制技術(shù)具有費(fèi)用低、耗時(shí)短、無二次污染、不破壞生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)[6]，已成為硫化物污染治理及回用的重要方法。硫氧化菌(Sulfur-oxidizing bacteria, SOB)是一類可將硫化物氧化產(chǎn)生單質(zhì)硫，或?qū)钨|(zhì)硫進(jìn)一步氧化為硫酸鹽的微生物[7]，對(duì)環(huán)境中還原性硫化物具有很好的控制作用。然而，直接使用游離細(xì)菌存在大量弊端，如細(xì)菌易被流水沖走、微生物難以適應(yīng)實(shí)際環(huán)境等弊端嚴(yán)重限制了生物修復(fù)的應(yīng)用[8-11]。為解決上述問題，微生物固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

微生物固定化技術(shù)總體上分為載體吸附法、交聯(lián)法和包埋法三大類。其中，載體吸附法通過物理吸附、化學(xué)或離子結(jié)合的方式將微生物細(xì)胞吸附到載體表面，其成本較低、操作簡(jiǎn)單、對(duì)細(xì)胞的活性影響較小，易于推廣應(yīng)用[12]。Skoronski等[13]利用石墨烯固定從Aspergillusoryzae提取的漆酶，研究發(fā)現(xiàn)固定后的漆酶對(duì)pH值及溫度耐受范圍增大；Vichuviwat等[14]分析了磚粒和沸石兩種載體對(duì)菌株ClostridiumbeijerinckiiTISTR 1461的固定效果，結(jié)果表明兩種固定化載體均提高了該菌株的丁醇產(chǎn)量。與其他載體相比，陶粒對(duì)微生物無毒，機(jī)械強(qiáng)度高，物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)且價(jià)格低廉，因此被作為合適的細(xì)胞固定化載體廣泛使用。龔浩等[15]利用陶粒作為濾料吸附去除水中的卡馬西平(CBZ)，當(dāng)進(jìn)水CBZ濃度為2 μg·L-1時(shí)，其最高去除率可達(dá)到40%；Zhou等[16]的研究表明以陶粒為載體的生物反應(yīng)器固定氨氧化細(xì)菌可取得良好的去除效果，硝酸根的去除率穩(wěn)定在90%左右；Rattanapan等[17]將2株硫氧化菌固定到陶粒上并應(yīng)用到生物濾池中，該系統(tǒng)表現(xiàn)出對(duì)硫化氫氣體較好的去除作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)硫氧化菌固定化的研究和應(yīng)用主要集中在對(duì)生物反應(yīng)器中硫化氫氣體脫硫方面，應(yīng)用固定化硫氧化菌對(duì)海水養(yǎng)殖生境硫化物污染進(jìn)行控制的研究較少。

在此背景下，本研究以膠州灣養(yǎng)殖區(qū)分離得到的硫氧化菌株嗜熱氫弧菌(Hydrogenovibriothermophilus)TT為對(duì)象，利用陶粒和沸石作為固定化載體，考察不同載體固定條件對(duì)其去除還原性硫化物的影響，并通過對(duì)載體進(jìn)行改性進(jìn)一步提高其對(duì)菌體的吸附作用，從而為海水養(yǎng)殖環(huán)境中硫化物的生物控制提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株來源 實(shí)驗(yàn)采用的硫氧化菌株TT分離自膠州灣海水養(yǎng)殖區(qū)，經(jīng)16S rDNA序列測(cè)序比對(duì)鑒定該菌株為嗜熱氫弧菌(Hydrogenovibriothermophilus)。該菌株微需氧，可同時(shí)利用有機(jī)碳源和無機(jī)碳源，將還原性硫化物氧化成單質(zhì)硫和硫酸鹽。該菌在較寬泛的溫度和pH范圍內(nèi)都能生長(zhǎng)，最優(yōu)生長(zhǎng)條件為：溫度30～40℃、pH=7～9，能較好的適應(yīng)海水養(yǎng)殖環(huán)境。

1.1.2 培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基成分(g·L-1)：Na2S·9H2O 4.5，NaHCO32.0，K2HPO41.2，KH2PO41.2，NH4Cl 0.4，MgCl20.2，F(xiàn)eC6H5O70.01，經(jīng)0.45 μm孔徑濾膜過濾的陳海水進(jìn)行配制，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，配制完成后120 ℃高溫高壓滅菌20 min，使用氮?dú)獯得?0 min以去除培養(yǎng)基中的溶解氧，創(chuàng)造缺氧環(huán)境。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：由于Na2S·9H2O極易被氧化，不易測(cè)得其準(zhǔn)確濃度，故選擇Na2S2O3·5H2O代替培養(yǎng)基中的Na2S·9H2O來配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基[18]，用于測(cè)定菌株氧化去除硫化物的效果，其它成分及操作不變。

1.2 固定化載體

本文使用的固定化載體為沸石和陶粒，將載體研磨過篩，得到18目(直徑為1 ～ 2 mm)、30目(直徑為0.6 ～1.0 mm)及60目(直徑為0.25 ～0.6 mm)三種粒徑的載體。

1.3 載體的預(yù)處理

使用0.1 mol·L-1的磷酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)蒸餾水的pH依次為1、3、5、6、8、9、11，取1g載體材料投進(jìn)5 mL不同pH的溶液中，150 r·min-1振蕩吸附30 min，靜置24 h，使用蒸餾水沖洗改性載體至沖洗液pH呈中性，105 ℃干燥2 h即得到改性載體；同樣取沸石和陶粒，蒸餾水清洗，105 ℃干燥2 h，即未改性載體；所有載體高壓蒸汽滅菌后備用。

1.4 固定化過程

將菌種按10%的接種量接入50 mL選擇性培養(yǎng)基，30 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h，然后在菌液(>109CFU·mL-1)中加入1 g載體材料，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h，進(jìn)行微生物細(xì)胞的吸附固定。使用無菌生理鹽水沖洗載體3次，除去表面未固定的游離細(xì)菌，獲得固定化菌劑。

1.5 分析檢測(cè)項(xiàng)目及方法

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株對(duì)硫化物的氧化能力

從圖1可以看出，該菌株在24 h時(shí)對(duì)4.65 g·L-1的Na2S2O3·5H2O的去除率可達(dá)到100%；而未加菌的對(duì)照組對(duì)硫化物也有約5%去除率，這可能是由于培養(yǎng)基中存在的微量氧氣造成的。通過與對(duì)照比較，可以確定約95%的硫化物去除是由微生物參與完成的。

圖1 非固定化硫氧化菌株TT對(duì)硫化物的氧化去除能力Fig.1 The sulfide removal rate of suspended strain TT

馮守帥等[22]研究的硫氧化菌ThermithiobacillustepidariusJNU-2以2 g·L-1的Na2S2O3為能源底物，24 h時(shí)可去除98%的Na2S2O3，同時(shí)單質(zhì)硫的最大產(chǎn)量可達(dá)到0.8 g·L-1。而Chen等[23]將硫氧化菌Penibacillussp.和Aneurinibacillusaneurinilyticus應(yīng)用于膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器，其對(duì)硫化物的氧化速率達(dá)到了3.0 g·(L·d)-1。與上述菌株相比，本文分離得到的硫氧化菌株TT擁有更高效的氧化還原性硫化物的能力。同時(shí)，硫化物菌株TT可在20～40 ℃之間均可獲得較好的硫氧化能力，其最優(yōu)生長(zhǎng)條件為：30～40 ℃，pH為7.0～9.0。該菌為兼性化能自養(yǎng)菌，可同時(shí)利用無機(jī)碳和有機(jī)碳作為碳源[24]。由于膠州灣養(yǎng)殖區(qū)夏季的平均溫度為27.8 ℃[25]，且該菌在堿性環(huán)境中可發(fā)揮較好的硫氧化能力，可見菌株TT可作為合適的工程菌株應(yīng)用于海水養(yǎng)殖生境的生物修復(fù)。

2.2 載體的選擇及效果

以18、30及60目的沸石和陶粒為載體，采用吸附的方法對(duì)硫氧化菌株TT進(jìn)行了固定化。固定后的載體在pH=7.0、30 ℃條件下對(duì)硫代硫酸鹽的去除效果如圖2，18目固定化菌劑24 h時(shí)對(duì)硫代硫酸鹽的去除率可達(dá)到42.7%,去除效果最好。

圖2 不同載體和粒徑對(duì)固定化效果的影響Fig.2 The effect of different carriers and particle size on immobilization

已知游離的菌液24 h時(shí)對(duì)硫代硫酸鹽的去除率為100%(見圖2)，可見固定化菌劑的去除率有所降低，這可能是由于大量的微生物細(xì)胞并未吸附到固定化載體上[26]，或是由于硫化物在載體材料中的擴(kuò)散遷移受到了限制[27]，從而導(dǎo)致固定后的菌劑硫氧化能力下降。與陶粒相比,不同粒徑沸石固定化菌劑對(duì)還原性硫化物的氧化能力遠(yuǎn)低于陶粒，這可能與載體的表面形態(tài)有關(guān)。沸石和陶粒的SEM圖如圖3，沸石表面無孔隙，但表面較粗糙；而陶粒表面有許多孔隙，比表面積較大，能夠吸附大量的微生物細(xì)胞并為其提供生長(zhǎng)空間[28]。

陶粒及沸石兩種載體均在18目粒徑下表現(xiàn)出了更好的硫氧化性能。研究表明，固-液界面相互作用過程中，滲透性較差的多孔介質(zhì)表面形成的水化膜限制了污染物的擴(kuò)散遷移，使得功能微生物無法與污染物充分接觸，從而影響固定化載體對(duì)目標(biāo)污染物的去除效果。顆粒粒徑會(huì)對(duì)多孔介質(zhì)的滲透性產(chǎn)生重要影響[29]。粒徑越大，多孔介質(zhì)的滲透性越好，良好的滲透性能夠保證液體中污染物與固定化菌劑中微生物進(jìn)行充分接觸，從而達(dá)到較好的去除效果。這也可能是18目粒徑下的固定化菌劑對(duì)硫化物去除效果好的原因。同時(shí)由于粒徑較小的載體較難與游離態(tài)菌液分離，難以應(yīng)用于實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境，故選擇18目的陶粒進(jìn)行以下研究。

圖3 未吸附載體沸石(a)及陶粒(b)Fig.3 SEM observation of zeolite(a) and ceramsite(b)

2.3 載體的預(yù)處理

對(duì)載體材料表面基團(tuán)或孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得合適的固定化材料已成為細(xì)胞固定化研究的重要方向[30]。陶粒內(nèi)部呈細(xì)密蜂窩狀微孔結(jié)構(gòu)，利用酸堿對(duì)陶粒進(jìn)行改性，置換陶?？椎乐性械陌霃酱蟮年栯x子，使孔洞的有效孔徑拓寬，增加表面積[31]，從而影響陶粒的離子交換和吸附吸能，增加吸附活性中心[32]。用酸堿改性處理后的陶粒分別吸附固定化硫氧化菌株TT，研究其對(duì)硫代硫酸鹽的去除能力，結(jié)果如圖4。

圖4 酸、堿改性對(duì)固定化效果的影響Fig.4 The effects of modified carriers onimmobilization

與未改性陶粒相比，采用酸堿改性方法處理過后的固定化菌劑對(duì)硫代硫酸鹽的去除能力均有顯著提高，而用1.0 mol·L-1NaOH處理的陶粒吸附菌可獲得更好的固定化效果。其中利用pH=8的NaOH溶液對(duì)陶粒載體進(jìn)行改性后進(jìn)行固定化，其固定化菌株的硫氧化能力提高了35%左右。

2.4 固定化顆粒表面結(jié)構(gòu)分析

載體的吸附特性不僅取決于它的孔隙結(jié)構(gòu)，同時(shí)其表面化學(xué)性質(zhì)也具有很大影響。而表面化學(xué)性質(zhì)主要由表面的官能團(tuán)決定，不同的官能團(tuán)對(duì)不同的吸附質(zhì)有明顯的吸附差別。采用傅里葉紅外光譜對(duì)未改性陶粒、酸改性陶粒及堿改性陶粒的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5。陶粒在3 400 cm-1處有一個(gè)O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1 081 cm-1為Si-O伸縮振動(dòng)峰，796、691及462 cm-1處為Si-O、Al-O彎曲振動(dòng)峰；酸堿改性并未改變陶粒紅外骨架，主要影響了陶粒本身的O-H含量，酸改性陶粒較未改性陶粒的O-H峰強(qiáng)度減弱，而堿改性的陶粒O-H峰強(qiáng)度增強(qiáng)。O-H這種極性較強(qiáng)的基團(tuán)的增加可以提高載體對(duì)弱極性物質(zhì)吸附的表面活性[33]。這可能是堿改性載體固定化效果提高的原因。

圖5 陶粒在不同改性條件下的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectrum of ceramsite obtained from different modified conditions

不同處理?xiàng)l件下的陶粒掃描電鏡圖譜如圖6。與未處理陶粒相比(見圖3)，酸堿改性的陶?？紫对龆啵缺砻娣e增大，這可能是酸堿改性后載體吸附能力提高的原因之一。同時(shí)堿改性陶粒5 μm左右的大孔隙較多，由于本研究中使用的微生物細(xì)胞長(zhǎng)度>1 μm，因此大孔隙的增加有利于微生物細(xì)胞的吸附。

2.5 固定化菌劑的重復(fù)利用性

固定化的一大優(yōu)勢(shì)就是固定化載體的重復(fù)利用，不同的固定方式?jīng)Q定了不同的復(fù)用性[34]。而相比較于其他的固定方法，吸附法的復(fù)用性最好[35]。固定化菌劑的復(fù)用性結(jié)果如圖7。

圖6 陶粒酸改性(a)及堿改性(b)后的掃描電鏡照片及吸附的菌體(c)Fig.6 SEM of acid(a) and alkali-modified ceramsite(b) and strain TT on carrier(c)

圖7 固定化菌劑的復(fù)用性Fig.7 The reusability of the immobilized sulfur-oxidizing bacteria cell

固定化菌劑在第一次使用過后，其對(duì)還原性硫化物的氧化能力得到了一定的提升，這表明微生物細(xì)胞可在陶粒載體上進(jìn)一步增殖。吸附于載體上的微生物細(xì)胞與載體間除物理吸附外可能發(fā)生了生物吸附，從而形成菌膜，增加菌體密度[36]。同時(shí)，重復(fù)使用過程中，載體上脫落下來的微生物會(huì)在底物充足的情況下進(jìn)一步增殖，在水中及吸附在載體上的微生物進(jìn)一步增多，導(dǎo)致重復(fù)使用后固定化菌劑對(duì)硫化物的去除率提高。6次重復(fù)使用后，固定化菌劑的硫氧化能力并沒有明顯變化，仍表現(xiàn)出顯著的分解代謝能力，說明該固定化菌劑具有較好的復(fù)用性并且能夠長(zhǎng)期應(yīng)用于海水養(yǎng)殖環(huán)境。

3 結(jié)語

以陶粒和沸石為載體，采用吸附的方法對(duì)具有高效硫氧化能力的菌株TT進(jìn)行了固定化。為了進(jìn)一步提高固定化效果，采用不同的改性方法提高載體的吸附性能，并考察了固定化菌劑的硫氧化能力。陶粒由于孔隙較多，固定化效果比沸石更好些；通過酸堿改性可提高固定化載體的吸附效果，其中堿改性陶粒(pH=8)的效果最好，硫氧化能力提高了35%，達(dá)到75%左右；堿改性陶粒對(duì)硫氧化菌株具有較好的吸附固定化能力，且復(fù)用性較好，在海水養(yǎng)殖生境修復(fù)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。