白璧輝， 謝興文， 李鼎鵬， 黃晉， 徐世紅

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅蘭州 730050；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州 730050）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨的含量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退化表現(xiàn)，致使增加了骨的脆性，導致易于發(fā)生骨折的一種全身性代謝疾病[1]。OP好發(fā)于中老年人。近年來，有關OP的防治更加規(guī)范細致，中西藥物治療能夠顯著增加患者的骨密度及骨強度，但不能使OP患者的骨重塑過程恢復平衡。新研發(fā)的促進骨合成的藥物在刺激新骨形成的同時也刺激了骨吸收，導致其療效并不穩(wěn)定。而針對激素水平進行治療的藥物由于靶向性不強，難以進行根本性治療，且某些藥物的不良反應較多，甚至會出現(xiàn)安全性問題。目前OP治療存在的不足，凸顯開展OP早診斷、早預防的意義。利用蛋白質(zhì)組學易感蛋白的定量技術，可以揭示OP每一階段的發(fā)生、發(fā)展的機理，特別是血清蛋白的表達改變，對于早診斷和早預防OP病變過程，具有重要的意義。中醫(yī)也逐漸將蛋白質(zhì)組學技術應用于OP的探究中，以探索中醫(yī)OP證候分型與蛋白質(zhì)的相關性以及中醫(yī)藥治療OP的蛋白質(zhì)水平作用途徑。以下通過概述蛋白質(zhì)組學在中醫(yī)藥治療OP的應用現(xiàn)狀，以期為中醫(yī)藥防治OP提供理論基礎。

1 蛋白質(zhì)組學概述

蛋白質(zhì)是生物生理功能的全面表達者，其結(jié)構(gòu)和功能的研究能夠幫助研究者發(fā)現(xiàn)生命體在病理狀態(tài)下的發(fā)展規(guī)律并闡述其病變機理。對于研究OP者，蛋白質(zhì)組學技術為一種非常有針對性的研究目標細胞和組織的工具[2]。目前生命科學的重點也已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了蛋白質(zhì)的研究上。蛋白質(zhì)能夠比基因更全面地反映生命體的功能及各種作用機制，而且蛋白質(zhì)是細胞代謝最主要的執(zhí)行者，同時也作為靶分子作用于多種致病因子。蛋白質(zhì)組學技術可以直接分析生物樣本如血清、尿液、腦脊液等，能夠客觀準確地反映血清中絕大多數(shù)蛋白的含量[3]。隨著分子技術的蓬勃興起，蛋白質(zhì)組學技術為尋找疾病的生物標志物提供了方向[4]。蛋白質(zhì)組學可表達更全面的疾病信息，更加接近生命體本質(zhì)的生理和病理狀態(tài)。通過蛋白質(zhì)組學比較不同狀況下細胞或組織中蛋白質(zhì)的數(shù)量及位置的差異，尋找疾病的特異蛋白質(zhì)，可為疾病的發(fā)生機制與診斷提供不同的標識，為新藥研發(fā)提供指導。因而，蛋白質(zhì)組學的研究有著廣泛的臨床及應用前景。

2 蛋白質(zhì)組學常用技術

2.1蛋白質(zhì)分離技術蛋白質(zhì)的分離技術是蛋白質(zhì)組學研究的重要部分，主要包括雙向凝膠電泳技術（2-DE）、雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術、高效液相色譜技術（HPLC）、雙向HPLC（2D-HPLC）技術、親和層析、毛細管電泳等6種分離技術，可用來分析從細胞、體液或組織中提取的復雜的蛋白質(zhì)混合物。根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，可分離數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)組成的復雜混合物，并可確定每種蛋白質(zhì)的相對含量。經(jīng)過分離蛋白質(zhì)樣品后，可得到分子的等電點及含量兩方面的信息。

2.2蛋白質(zhì)鑒定技術現(xiàn)在普遍應用的蛋白質(zhì)鑒定技術為生物質(zhì)譜分析技術，主要包括早期的基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜（MALDI-MS）、電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）、表面增強激光解吸離子化質(zhì)譜（SELDI-MS），以及后期改良的表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術、同位素標記術和標簽技術（ICAT）、蛋白質(zhì)芯片（protein chips）等。由于該類技術具有迅速、靈敏、準確以及高通量、自動化等優(yōu)點，并能進行蛋白質(zhì)序列分析和翻譯后修飾的分析（糖基化、磷?；F(xiàn)已成為蛋白質(zhì)組學研究中分析與鑒定肽和蛋白的最重要的手段。

2.3生物信息學目前生物信息學已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究中重要構(gòu)成部分，研究人員已經(jīng)為此建立了多個用于蛋白質(zhì)組學研究的數(shù)據(jù)庫，最常用的3種為SWISS-PROT、EMBL和GEO，其中SWISS-PROT是最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。研究者通過在蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫中尋找與對比，可更全面地獲取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從而更系統(tǒng)高效地進行分析，起到對比鑒定的作用。

3 蛋白質(zhì)組學技術在中醫(yī)藥治療OP中的應用

3.1單味中藥大量研究表明單味中藥對OP的治療具有良好的效果。用于治療OP的中藥主要包括杜仲、熟地黃、淫羊藿、仙茅、骨碎補等。目前已提取多種中藥的有效成分用于治療，但對于其機理的探討仍較為匱乏。對于單味中藥治療OP作用機理的蛋白質(zhì)組學研究，曾建春等[5]分析了杜仲誘導MSCs向成骨細胞分化的調(diào)控機制，通過電泳分離得到641個蛋白點，并選取了其中的75個進行質(zhì)譜分析，證明杜仲可通過6個功能蛋白調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖與分化，從而達到治療OP的效果；薛黎明[6]運用蛋白質(zhì)組學研究淫羊藿、仙茅單味藥防治OP的作用機理，結(jié)果顯示，淫羊藿中的總黃酮、仙茅中的苯甲酸酯類總酚苷能明顯改善OP導致的尿液和血液代謝產(chǎn)物的變化，并參與能量、氨基酸和脂肪的代謝以及氧化應激、細胞骨架形成，同時發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和仙茅苷及其配伍可改善成骨細胞和破骨細胞的線粒體膜電勢和三磷酸腺苷（ATP）含量。骨碎補主要通過調(diào)控骨代謝相關分子及骨形成蛋白通路上相應的靶點，發(fā)揮抑制骨吸收及促進骨形成的作用，最終達到治療OP的目的[7]。

3.2中藥復方治療OP的中藥復方主要包括左歸丸、六味地黃丸、獨活寄生湯、二仙湯等經(jīng)典名方。相關的臨床實驗研究報道此類復方可通過促進骨骼礦化，維持骨代謝平衡，達到減輕臨床癥狀，提高治療效果的目的。盧嚴方等[8]運用蛋白質(zhì)組學技術對美國國家生物信息中心（NCBI）中的GEO數(shù)據(jù)庫中六味地黃丸治療絕經(jīng)期腎陰虛OP的相關信息進行檢索，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸在治療腎陰虛型OP絕經(jīng)期患者時，其基因TNP1和MAP3K10的表達明顯增加，而ZNF家族基因和XRN1、XPO1、NUP54等基因的表達顯著下降；故認為該復方通過促進雌激素表達及與其受體結(jié)合，保持免疫應答平衡而促進骨組織形成，從而達到改善骨代謝作用。而陳娟等[9]采用傳統(tǒng)的免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸治療腎陰虛型OP絕經(jīng)期患者是通過調(diào)控JAK/STAT通路中IRF1基因信號干預免疫功能而實現(xiàn)的。以上文獻分析表明蛋白質(zhì)組學技術比免疫組化方法的研究結(jié)果更加全面，并有助于進一步的探析。

對于二仙湯、左歸丸、壯骨止痛方作用機制的研究，劉志文等[10]研究二仙湯對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨蛋白質(zhì)組的影響，檢測股骨組織蛋白，通過定量分析差異表達蛋白的強度，共發(fā)現(xiàn)41種差異表達蛋白（主要包括生物氧化相關蛋白、信號轉(zhuǎn)導途徑相關蛋白等），發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白質(zhì)如碳酸酐酶2和整合素β1是二仙湯的作用靶點。張穎等[11]對去卵巢OP大鼠的雙側(cè)股骨骨髓進行蛋白質(zhì)雙向電泳并對其電泳圖譜進行分析，篩選出與左歸丸療效的相關蛋白，并進行質(zhì)譜分析，共篩選出23個差異蛋白點，鑒定出其中的11個蛋白質(zhì)點，包括果糖酸縮酶A、抗氧化蛋白6、α烯醇化酶、烯醇化酶3、白蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3等；發(fā)現(xiàn)左歸丸通過調(diào)節(jié)含以上相關蛋白的細胞的增殖、分化、代謝、凋亡等來治療OP。楊軍等[12-13]對去卵巢大鼠OP模型股骨的蛋白質(zhì)進行雙向電泳，獲得各組總蛋白質(zhì)的圖譜，用圖像分析各組間差異蛋白質(zhì)點并結(jié)合蛋白質(zhì)生物信息庫（MLD），對各蛋白質(zhì)進行鑒定，發(fā)現(xiàn)X1（胰島素受體蛋白）、X2（熱休克同源蛋白）、X3（分泌顆粒素Ⅱ）這3種差異蛋白在壯骨止痛方治療OP的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

3.3針刺治療針灸作為臨床上的常用治療方法，能夠從整體或多臟腑進行靶點性的全面治療，療效肯定并具有安全性高、成本低等優(yōu)點，在治療OP方面具有一定的優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)針灸治療OP能夠抑制破骨細胞關鍵調(diào)控因子OPG和RANKL mRNA表達，刺激成骨細胞特異基因CB1 mRNA表達，調(diào)節(jié)骨量平衡，同時通過提高Ⅰ型膠原氨基端延長肽水平及降低β-Ⅰ型膠原羧基端肽來改善臨床癥狀[14-15]。秦瑋等[16]采用蛋白質(zhì)組學技術分析針刺命門穴治療絕經(jīng)后OP的機制：以電針刺激去卵巢OP大鼠命門穴，觀察去卵巢OP大鼠下丘腦骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）及其信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad1/5表達的調(diào)節(jié)機制。實驗結(jié)束后，采用免疫組化法檢測下丘腦BMP-2及其信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad1/5的表達。結(jié)果顯示實驗組下丘腦BMP-2及其信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad1/5陽性細胞總面積、陽性細胞平均灰度值與兩個模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。以上結(jié)果不僅為針刺命門穴治療絕經(jīng)后OP提供一定的理論依據(jù)，而且為運用蛋白質(zhì)組學技術研究針刺治療OP的作用機制提供了思路與方法。

4 討論

關于OP發(fā)病機理，目前認為其機制與骨的抑制、吸收及骨形成之間的失衡有關，研究多集中在基因水平，如OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)、Wnt/βcatenin 途徑、Cbfa1、Osterix、Runx、Cathepsin K等轉(zhuǎn)錄因子及酶的作用機制已經(jīng)逐漸被揭示，但大多以單基因或小基因、單通路或小通路研究為主，未能從整體蛋白質(zhì)水平去探索發(fā)病規(guī)律[17]。蛋白質(zhì)組學的研究能直接反映1個基因組或者1種細胞/組織中攜帶的信息及所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是完成生命活動的最終形式，能比基因更加真實全面地反映生物體的功能及各種作用機制[18-19]。中醫(yī)學相對于現(xiàn)代醫(yī)學雖然對疾病的微觀認識和處置方法有所不同，但中醫(yī)也逐漸將蛋白質(zhì)組學方法應用于疾病的研究。采用蛋白質(zhì)組學技術篩選和鑒定血清中OP狀態(tài)和正常生理狀態(tài)下的差異表達蛋白，將有利于OP的發(fā)生機理的闡明，為中醫(yī)藥早期診斷與及時治療OP提供理論基礎，并為后期研發(fā)針對OP人群的治療藥物提供依據(jù)。

目前針對中醫(yī)藥治療OP的蛋白質(zhì)組學研究還比較少，且以在體動物和離體細胞實驗為主，文獻報道數(shù)量不多。隨著蛋白質(zhì)組學技術的改進及其在OP防治領域的進一步應用，將會進一步發(fā)掘出與OP疾病相關的蛋白質(zhì)。探究引起OP的蛋白質(zhì)組成，揭示差異蛋白影響OP發(fā)生的機理，并利用蛋白質(zhì)組學的現(xiàn)代化技術對中醫(yī)辨證分型進行探究，利用生物信息學資料比較分析實現(xiàn)微觀辨證分型，將對促進對OP早期診斷和預防、及時治療和中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重大意義。