范銀星 柴榮 韓一平

海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院呼吸與危重癥科,上海 200433

免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICPis)近年來發(fā)展迅速,其中細胞毒T 淋巴細胞抗原4(cytotoxie T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性細胞死亡受體1/配體1(programmable cell death protein 1/L1,PD-1/L1)抑制劑是最主要的2種[1]。多種腫瘤的臨床研究結(jié)果證實,ICPis一旦產(chǎn)生應(yīng)答,有實現(xiàn)腫瘤長期控制的可能[2-3],但伴發(fā)的免疫相關(guān)不良反應(yīng)(immune-related adverse events,irAE)常成為ICPis應(yīng)用的阻礙。因此,深入研究irAE發(fā)生的機制,發(fā)現(xiàn)具有早期預測作用的生物標記物對提高ICPis的有效性、安全性和耐受性具有重要意義。本文從irAE 的概況、irAE 的發(fā)生機制及預測irAE的標記物3個方面對irAE 研究進展進行綜述。

1 irAE的概況

irAE是由免疫系統(tǒng)非特異性激活引起的,全身系統(tǒng)均可受累,大部分irAE 程度較輕且可逆,也有部分irAE 存在致命可能,ICPis治療初始的6個月內(nèi)是發(fā)生irAE 的高峰期[4-5],但治療全程乃至治療結(jié)束后均有發(fā)生irAE 的風險。Wang等[6]的meta分析顯示,3 545例ICPis治療患者的總體死亡率為0.6%,最主要的致死原因有結(jié)腸炎、神經(jīng)毒性、肺炎、肝炎和心肌炎。不同ICPis的irAE 發(fā)病情況差異較大,通常CTLA-4抑制劑irAE發(fā)生率和嚴重程度均高于PD-1/L1抑制劑[7]。約90%CTLA-4治療患者會發(fā)生不同程度的irAE,嚴重irAE 的發(fā)生率為10%～42%,PD-1/L1抑制劑irAE 總發(fā)生率約70%,11%～20%的患者表現(xiàn)較為嚴重[8]。對于ICPis聯(lián)合治療,嚴重irAE 的發(fā)生率明顯增高[9]。目前,irAE的治療多基于臨床經(jīng)驗,多家權(quán)威腫瘤治療機構(gòu)已發(fā)布了irAE 的臨床管控指南[10-11]。治療根據(jù)不良反應(yīng)通用術(shù)語標準分4個等級,輕度irAE 無需停藥,僅需對癥處理或口服小劑量激素;中重度irAE 治療首先需停用ICPis,之后根據(jù)具體表現(xiàn)選擇激素或免疫抑制劑等多種治療方法。

2 irAE發(fā)生機制的研究進展

ICPis引發(fā)irAE的機制尚不清楚,現(xiàn)研究表明有多種機制參與其中,包括ICPis與非腫瘤組織上的靶分子結(jié)合誘導下游的免疫反應(yīng),新型T 細胞或耗竭T 細胞對非靶組織上有交叉反應(yīng)的抗原再次激活,自身抗體以及炎性細胞因子的產(chǎn)生等。

2.1 非腫瘤組織表達ICPis識別的靶點 不同ICPis引發(fā)的irAE 表現(xiàn)出顯著的器官特異性,CTLA-4抑制劑相關(guān)腸炎和垂體炎發(fā)生率比PD-1/L1抑制劑高6～9倍,而PD-1/L1抑制劑相關(guān)肺炎和甲狀腺炎發(fā)生率比CTLA-4 抑制劑高6倍[12],這可能與不同組織表達免疫檢查點組分的差異相關(guān)。Iwama等[13]研究發(fā)現(xiàn),小鼠反復接受CTLA-4單抗注射后,垂體出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤,外周血垂體抗體水平升高,在20例黑色素瘤患者中同樣發(fā)現(xiàn),采用Ipilimumab前所有患者外周血垂體抗體均為陰性,治療后發(fā)生垂體炎的7例患者垂體抗體轉(zhuǎn)為陽性,而未發(fā)生垂體炎的13例患者垂體抗體仍為陰性。該研究間接證實垂體組織細胞可能表達某種特異性抗原,被CTLA-4單抗激活的T 細胞識別后產(chǎn)生了垂體抗體,從而導致垂體炎。Caturegli等[14]的研究則直接證實垂體細胞中表達的CTLA-4抗原起到新抗原的作用,與外源性CTLA-4抗體結(jié)合引發(fā)免疫反應(yīng),破壞垂體實質(zhì)導致垂體炎的發(fā)生。該研究組收集6 例接受過Ipilimumab治療的患者尸檢的垂體切片,通過免疫組織化學染色檢測垂體前葉素、免疫細胞、免疫球蛋白、補體和CTLA-4抗原表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)生嚴重垂體炎的患者CTLA-4抗原水平最高,且CTLA-4抗原的高表達與T 細胞浸潤和IgG 依賴性補體結(jié)合以及吞噬作用呈正相關(guān)性。其他組織器官是否因表達類似ICPis可識別的靶點導致irAE,仍有待進一步研究證實。

2.2 ICPis誘發(fā)新抗原特異性T 細胞或先前休眠的抗原特異性T 細胞的重新激活 一項ICPis聯(lián)用引發(fā)嚴重心肌炎的研究發(fā)現(xiàn)[15],炎性改變的心肌細胞中有大量CD4+、CD8+T 細胞浸潤,而沒有B細胞或自身抗體,且浸潤心肌和腫瘤組織的T 細胞屬于同一克隆,表明心肌和腫瘤組織表達的共同抗原可激活這種特異性T 細胞從而引發(fā)心肌炎。Shirali等[16]報道,6例有長期服用致腎炎風險藥物病史的非小細胞肺癌患者,在采用Nivolumab一定療程后均出現(xiàn)急性間質(zhì)性腎炎。Koda等[17]也有類似的個案報道,兩項研究的腎穿結(jié)果均發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)中有大量CD4+T細胞浸潤,由此認為,PD-1抑制劑可能重新激活了原本對致腎炎藥物免疫耐受的效應(yīng)性T 細胞的活性,使其產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)引起腎功能損傷。以上研究中大部分患者停用致腎炎藥后腎功能可部分自行恢復,亦證實了這種假說的合理性。

2.3 自身抗體的產(chǎn)生 Osorio等[18]研究發(fā)現(xiàn),80%治療前抗甲狀腺抗體陽性的患者在pembrolizumab治療過程中發(fā)生了自身免疫性甲狀腺炎,表明PD-1抑制劑可增強先前存在的抗甲狀腺抗體活性,這可能是甲狀腺irAE的重要病因。另外,抗雙鏈DNA 和抗核抗原抗體是自身免疫性疾病常見的致病性抗體,Fadel等[19]報道,采用Ipilimumab 2個療程后出現(xiàn)了狼瘡樣腎小球腎炎的患者,外周血中檢測出抗雙鏈DNA 和抗核抗原抗體,這些自身抗體在停藥3個月后自行轉(zhuǎn)陰,患者的腎功能也逐步恢復正常,進一步表明自身抗體致irAE的可能。新近,Das等[20]研究發(fā)現(xiàn),接受ICPis聯(lián)合治療的黑色素瘤患者外周血循環(huán)B 細胞總數(shù)顯著少于單藥治療患者,但漿細胞比例顯著升高。漿細胞是分泌介導固有免疫反應(yīng)抗體的主要細胞,這可能是ICPis聯(lián)合治療irAE發(fā)生率高的原因之一。至今相關(guān)研究較少,但綜上所見,自身抗體在irAE的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用。

2.4 細胞因子的產(chǎn)生 irAE 是一種自身免疫相關(guān)的炎癥反應(yīng),細胞因子在其中發(fā)揮了重要的作用。IL-17主要由輔助性T 細胞17(T helper cell17,Th17)分泌,它是一種促炎細胞因子,已被證實在多種自身免疫疾病中發(fā)揮作用。CTLA-4抑制劑可激活多種T 細胞亞型,包括Th17,從而刺激IL-17分泌誘發(fā)自身免疫反應(yīng)[21]。Tarhini等[22]報道,Ipilimumab治療黑色素瘤并發(fā)腸炎的患者血中IL-17 顯著升高。在CTLA-4 相關(guān)腸炎小鼠模型外周血中也觀察到IL-17的升高[23],這些研究為IL-17阻滯劑治療ICPis相關(guān)腸炎提供了一定的理論支持。但IL-17阻滯劑有減弱ICPis抗腫瘤作用的風險[24],也需引起足夠的重視。也有其他細胞因子的相關(guān)研究,Johnson等[15]研究發(fā)現(xiàn),ICPis相關(guān)心肌炎患者的心臟、骨骼肌和腫瘤細胞中,包括趨化因子配體10 在內(nèi)的多種炎性因子的RNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。Murakami等[25]報道,ICPis相關(guān)急性間質(zhì)性腎炎患者血漿中促炎因子IL-1Ra、趨化因子配體10和腫瘤壞死因子均顯著升高。不同的細胞因子在irAE的發(fā)生過程中具體起到何種作用還需要進一步深入研究。

irAE的發(fā)生主要與免疫功能紊亂相關(guān),而其表現(xiàn)出的異質(zhì)性,包括受累器官的廣泛性,臨床表現(xiàn)的多樣性以及嚴重程度的差異性均提示以上的研究結(jié)果不能完全解釋irAE的發(fā)生機制,未來需要更加全面深入的觀察與研究。

3 irAE的預測標記物

隨著irAE發(fā)病機制研究的深入,irAE 預測標記物的相關(guān)研究發(fā)展迅速,目前已發(fā)現(xiàn)腸道菌群、免疫細胞浸潤、基因突變多態(tài)性、自身抗原抗體以及某些炎性因子具有一定的預測價值。

3.1 腸道菌群成分的改變 人體腸道內(nèi)大約寄生著1 014個細菌,共有約300～1 000個不同種類,統(tǒng)稱為腸道共生菌群,這些菌群的基因總數(shù)是人體基因的100倍[26]。腸道菌群參與人體多種病理生理過程,在調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答方面有重要的作用[27]。腸道菌群對ICPis治療有效性和毒性反應(yīng)的影響近年來受到極大的關(guān)注。Vétizou 等[28]發(fā)現(xiàn),腸道無菌的MCA205肉瘤小鼠經(jīng)強飼脆弱擬桿菌和洋蔥伯克霍爾德氏菌后腹腔注射CTLA-4單抗,20 d后小鼠結(jié)腸黏膜微損傷程度明顯輕于未強飼細菌的小鼠。這種保護作用被認為與脆弱擬桿菌調(diào)動樹突狀細胞,促進黏膜上的可誘導共刺激分子表達的調(diào)節(jié)性T 細胞(regulatory T cells,Tregs)增殖有關(guān)[29]。Sivan等[30]報道,通過給小鼠強飼或糞菌移植雙歧桿菌,可明顯增強PD-1/L1抑制劑控制腫瘤生長的作用,并減輕細胞毒性T 淋巴細胞介導的免疫反應(yīng),機制研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌處理后的小鼠腫瘤微環(huán)境中浸潤了大量CD8+T 細胞和腫瘤特異性T 細胞,提示雙歧桿菌是以非抗原依賴性方式改善小鼠抗腫瘤免疫功能。

來自人群的相關(guān)研究證實了腸道菌群的作用。Routy等[31]發(fā)現(xiàn),在ICPis治療前或治療初始應(yīng)用廣譜抗生素與未用抗生素的患者相比,疾病無進展時間(3.5月比4.1月,P=0.017)和總生存期(11.5月比20.6月,P＜0.001)均顯著縮短,這種負性作用可能與廣譜抗生素破壞腸道菌群組成相關(guān)。Dubin等[32]報道,Ipilimumab治療的黑色素瘤患者中,擬桿菌門細菌比例高的患者發(fā)生腸炎的風險顯著降低,機制研究發(fā)現(xiàn),缺乏細菌多胺轉(zhuǎn)運和B組維生素合成的遺傳途徑與結(jié)腸炎風險增加相關(guān)。Chaput和Frankel等[33-34]均發(fā)現(xiàn),Ipilimumab治療的患者糞菌類群中,厚壁菌門的瘤胃菌科(如普拉梭菌)的豐度較高而擬桿菌門豐度低的患者發(fā)生結(jié)腸炎的風險更高。以上研究均證實腸道菌群對ICPis治療存在重要的影響,檢測腸道菌群的組成是預測ICPis 有效性和irAE 發(fā)生風險的潛在方法。16sRNA 測序平臺是常用的檢測細菌種類的方法,但由于平臺及患者個體差異較大,目前不能明確具有改善預后作用的菌群,但通過服用或糞菌移植具有改善預后作用的菌群提高ICPis治療的有效性,降低irAE 的發(fā)生率,將是未來研究的重要方向。

3.2 外周血和腫瘤微環(huán)境中不同亞型的免疫細胞浸潤 目前關(guān)于Tregs、嗜酸粒細胞和B細胞的研究較多。Tregs是效應(yīng)性T 細胞的負性調(diào)節(jié)細胞,生理情況下主要參與維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。腫瘤浸潤性Tregs可以上調(diào)腫瘤微環(huán)境中PDL-1、PDL-2、IL-1R2和趨化因子受體8 等負性免疫檢查點的表達,幫助腫瘤細胞免疫逃逸。研究表明,CTLA-4單抗發(fā)揮抗腫瘤活性的重要途徑之一就是選擇性減少瘤內(nèi)Tregs[35],同時,也是導致自身免疫易感性的增加的原因[36]。Liu等[37]報道,Tregs的消耗可能是受累器官中效應(yīng)性T 細胞增加和血液中干擾素-γ及腫瘤壞死因子水平升高介導的。另外,Tregs在腸道免疫耐受中也有重要的作用,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些腸道共生菌如普拉梭菌可增加Tregs水平,這可能是腸道某些共生菌群導致腸炎風險增高的機制之一[33]。

關(guān)于嗜酸粒細胞,Jaber等[38]報道,抗CTLA-4 治療發(fā)生皮膚irAE的患者外周血和受累皮膚中嗜酸粒細胞顯著增加。雖然PD-1/L1抑制劑治療尚未發(fā)現(xiàn)類似的關(guān)聯(lián)[39],但在對ICPis聯(lián)合治療導致的皮膚紅斑病理活檢時發(fā)現(xiàn)不同程度的嗜酸粒細胞的浸潤[40],均提示嗜酸粒細胞有作為潛在預測因子的可能。

B細胞也在irAE中發(fā)揮了作用,Das等[20]發(fā)現(xiàn),ICPis聯(lián)合治療早期,外周血B細胞的變化與3/4級irAE顯著相關(guān),發(fā)生3/4級irAE患者的B細胞總數(shù)下降,但記憶性B 細胞亞型CD21lowB 細胞和漿細胞比例上升,CD21lowB細胞表面淋巴組織歸巢相關(guān)因子CXCR4 和CXCR5表達水平較低,表明CD21lowB 細胞向非淋巴組織浸潤的能力較強,可能有助于介導的炎癥發(fā)生。因此,外周血B細胞計數(shù)和B 細胞亞型分析有預測irAE 發(fā)生的潛在價值。檢測免疫細胞預測irAE仍處于初始階段,但新型流式細胞分析平臺可以以生物學相關(guān)行為定義免疫細胞亞群,為明確具有預測價值的免疫細胞亞型提供了可能[41]。

3.3 基因多態(tài)性 CTLA-4和PD1/PD-L1通路在抑制自身反應(yīng)性T 細胞活性和維持機體免疫耐受中起關(guān)鍵作用,CTLA-4基因功能性突變很常見,這是宿主維持對病毒或胞內(nèi)感染抵抗性的重要機制[42]。有研究發(fā)現(xiàn),CTLA-4和PD1/PD-L1的這種基因多態(tài)性與多種自身免疫疾病相關(guān)[43-44]。而irAE與自身免疫性疾病有很多相似的臨床表現(xiàn),可見CTLA4和PD1/PDL-1通路以及其他免疫調(diào)節(jié)途徑的基因變異對irAE 的易感性有潛在的預測作用。Patil等[45]對ICPis治療的黑色素瘤患者的腫瘤樣本進行全外顯子測序,發(fā)現(xiàn)了14 個突變基因在發(fā)生結(jié)腸炎的患者中富集?；蚪M全外顯子測序檢測腫瘤突變負荷已被證實有預測ICPis有效性的作用[46],類似的方法是否可預測irAE仍需深入研究。

3.4 自身抗原抗體 在ICPis治療過程中監(jiān)測某些自身特異性抗原抗體的變化可能是預測irAE 的有效方法。Kobayashi等[47]研究證實,在Nivolumab治療開始后的24周內(nèi),甲狀腺irAE在抗甲狀腺抗體陽性組(3/6)的發(fā)生率顯著高于抗體陰性組(1/60)(P＜0.001)。一項Ipilimumab聯(lián)合卡介苗治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的1期臨床試驗發(fā)現(xiàn)[48],2例發(fā)生嚴重irAE的患者外周血中自身抗體水平顯著升高,而且這些自身抗體在irAE出現(xiàn)之前即已被檢測到,表明動態(tài)監(jiān)測自身抗體譜可能是預測irAE 的方法。目前蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)可同時檢測針對大量靶標的特異性抗體,應(yīng)用這種技術(shù)對比發(fā)生和未發(fā)生irAE患者循環(huán)自身抗體的差別和治療過程中自身抗體水平的變化,可從中篩選潛在的預測irAE標記物。

3.5 免疫細胞釋放的細胞因子 IL-17在腸道irAE發(fā)生過程中起到了重要的作用[22-23],Tarhini等[49]研究發(fā)現(xiàn),如IL-17基線水平較高,則Ipilimumab治療引發(fā)3～4級結(jié)腸炎的風險增加,表明IL-17 有腸道irAE 預測價值。Fujimura等[50]對Th17另一個標記物趨化因子配體5和腫瘤相關(guān)巨噬細胞標記物可溶性CD163 的研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生irAE的患者組血漿可溶性CD163和CXCL5較基線顯著升高,提示可溶性CD163和趨化因子配體5可能有預測irAE的作用。Matsuo等[51]評估PD-1抑制劑應(yīng)用前后外周血中88種可溶性免疫介質(zhì)水平的變化與預后和irAE 的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),治療前后外周血CXCL2水平下降和基質(zhì)金屬蛋白酶2水平上升的患者無進展時間和總生存期顯著延長,而irAE發(fā)生率也相對較高。以上研究提示細胞因子與irAE的發(fā)生存在密切的關(guān)系,但距離應(yīng)用于預測irAE的發(fā)生還有很長的路要走。

4 展望

ICPis的臨床應(yīng)用發(fā)展迅速,不同ICPis的聯(lián)合,與化療、放療、靶向藥物、血管內(nèi)皮抑制劑等其他治療方法的聯(lián)合以及可手術(shù)患者的早期輔助治療的臨床試驗正如火如荼的開展,ICPis未來必將全面改變多種腫瘤的治療策略。irAE無疑是拓展ICPis應(yīng)用的阻礙,目前我們對irAE的研究尚淺,但最新的DNA、RNA、蛋白質(zhì)組學檢測技術(shù)可以幫助我們逐步了解irAE 發(fā)生的機制,發(fā)現(xiàn)預測irAE 的標記物,篩選出irAE 發(fā)生風險較高的患者,最終達到提高ICPis治療的安全性與有效性的目的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突