王承倩 鄭躍杰 馬卓婭

汕頭大學附屬深圳市兒童醫(yī)院呼吸科518038

過敏性疾病即變態(tài)反應性疾病,包括濕疹、過敏性鼻炎、過敏性哮喘,過敏性結膜炎、食物過敏等,近幾十年來逐漸增加,引起了全世界的高度關注。針對過敏性疾病的治療,目前主要為藥物對癥治療 (包括抗組胺藥物、糖皮質激素、白三烯受體調節(jié)劑)和過敏原免疫治療(allergen immunotherapy,AIT)。與對癥藥物治療相比,AIT 是唯一可能改變過敏性疾病自然進程的對因治療,可以阻止兒童過敏性鼻炎進展為過敏性哮喘,并且療效可在療程結束后維持數(shù)年時間[1-3]。目前常用的AIT 方法有皮下免疫治療 (subcutaneous immunotherapy,SCIT)和舌下免疫治療 (sublingual immunotherapy,SLIT)兩種。

當前AIT 的機制尚不完全清楚,主要有以下幾種觀點[4-6]：(1)肥大細胞和嗜堿粒細胞早期脫敏的誘導 (活化閾值的改變); (2)促進調節(jié)性T 細胞 (regulatory T lymphocytes,Tregs)和調節(jié)性B 細胞 (regulatory B lymphocytes,Bregs)的產生; (3)Ig E 和IgG4 的調節(jié);(4)Th1/Th2失調的糾正;(5)抑制嗜酸粒細胞的活化和遷移等。其中Bregs 與Tregs 是重要的作用細胞。關于Tregs的作用機制,既往已有較多研究,而且關于Bregs,現(xiàn)有的研究更多地集中于其在自身免疫性疾病中的作用機制,對其在AIT 中的機制研究相對較少,本文將對Bregs在AIT 治療過程中的研究進展作一綜述。

1 調節(jié)性B細胞

1.1 Bregs的分類及亞型 Neta等[7]在遲發(fā)性超敏反應豚鼠模型中發(fā)現(xiàn)了一類抑制性B細胞,可以抑制T 細胞的功能。Wolf等[8]在小鼠實驗性自身免疫性腦炎模型中發(fā)現(xiàn),缺乏調節(jié)性B 細胞的小鼠,不能從該病中恢復,提示Bregs免疫抑制功能的重要性,因此Bregs逐漸引起人們關注。此后,在自身免疫性疾病[9]、病毒感染、外科疾病[10]等多種疾病中均開展了關于Bregs的研究,對Bregs的分型、細胞因子、表面標志、作用機制等研究不斷深入。目前發(fā)現(xiàn),Bregs并不是一種單一表型的細胞,我們很難找到某一種特定的標志來定義區(qū)分它。從幼稚B細胞,到未成熟B細胞,再到分化成熟的B 細胞、漿細胞,均可發(fā)現(xiàn)Bregs的存在,因此其具有表型多樣性的特點[6]。目前在人類中發(fā)現(xiàn)的亞型主要有[11-12]：(1)B10/前B10細胞,是最多見也是研究最深入的Bregs,由Yanaba等在野生型小鼠脾內分離出,表達CD5+CD1dhi,占小鼠脾內B 細胞的1%～3%,人類外周血中B10 細胞比例在童年期間高達30%,遠遠高于健康新生兒 (3%～4%)和成年人 (7%～9%),其表達CD24hiCD27+CD148hiCD48hi,主要通過分泌IL-10產生抑制作用[13-14]; (2)Br1 細胞,表達CD19+CD25hiCD71hi,在外周血中發(fā)現(xiàn)特異性產生高水平的IL-10和IgG4,并有效抑制抗原特異性CD4+T 細胞增殖[15];(3)過渡B細胞,表達CD19+CD24hiCD38hi,在外周血及炎癥局部發(fā)現(xiàn),也可產生IL-10; (4)表達CD27intCD38+的漿細胞,可產生IL-10和免疫球蛋白[16];(5)產生轉化生長 因 子 β (transforming growth factor-β,TGF-β)的Breg(Br3),在小鼠腸炎模型中發(fā)現(xiàn),表達CD5+CD19+CX3CR1+[17]。

1.2 細胞因子 Bregs 主要通過產生IL-10、TGF-β、IL-35及表面結合和細胞內分子,包括CD19、CD21、CD23、CD24、CD5、CD62L、MHC-Ⅱ、fas配體、T 細胞免疫球蛋白、程序性死亡配體、黏蛋白結構域 (TIM)-1、CD138、細胞內信號轉導分子信號轉導、轉錄激活因子3以及髓系分化反應基因88 等表達免疫負向調節(jié)作用[18]。其中主要的細胞因子有以下幾種：

1.2.1 IL-10 IL-10是一種重要的抑制性細胞因子,多種細胞 (單核細胞、T 細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、肥大細胞、B 細胞)均可產生,高產IL-10 的Treg稱為IL-10分泌1型調節(jié)性T (Tr1)細胞,Bregs的多種亞型均可產生該因子,主要有B10 細胞和Br1 細胞[19]。它有著極為強大的免疫抑制功能,不僅在建立對變應原的外周耐受性中起重要作用,而且在保護宿主免受對病原體以及自身免疫疾病的過度炎癥反應、調節(jié)B 細胞存活、類別轉換重組和漿細胞分化中均有一定作用。對于T細胞來說,IL-10通過抑制炎性細胞因子、趨化因子和趨化因子受體的產生,以及抑制單核/巨噬細胞和樹突狀細胞上MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80/CD86的表達,可進一步抑制CD4+T 細胞的增殖。而對B細胞來說,IL-10可以誘導其存活、擴增和分化,并在誘導Ig G4產生和抑制Ig E中起主要作用[15,20]。Stanic等[21]用人IL-10 轉染原代人B 細胞,采用ELISA、磁珠測定法、流式細胞術 (flow cytometry,FMC)和定量實時熒光聚合酶聯(lián)反應等技術,發(fā)現(xiàn)過表達IL-10的B細胞可以降低促炎性細胞因子 (TNF-α、IL-8和巨噬細胞炎性蛋白1α)的水平,并且增強了抗炎性IL-1受體拮抗劑和血管內皮生長因子的產生,同時,該類細胞分泌IgE較少并且有效地抑制外周單個核細胞中的促炎細胞因子產生、單核細胞衍生的樹突細胞的成熟和體外抗原特異性增殖,表明IL-10在誘導B 細胞免疫調節(jié)表型中發(fā)揮重要的抗炎和免疫抑制作用。

1.2.2 TGF-β TGF-β也是一種具有強大免疫調節(jié)能力的多效性細胞因子,在傷口愈合,組織重塑和免疫調節(jié)及抑制免疫反應方面具有非常重要的作用,特別是可以誘導和維持過敏原的外周耐受[22],Treg細胞是TGF-β的主要來源。TGF-β通過多種途徑抑制B 細胞和效應T 細胞的增殖、分化和生存。盡管TGF-β抑制了大多數(shù)免疫球蛋白的類別轉換,但它可以促進小鼠模型中分泌Ig A 的漿細胞的分化、促進朗格漢斯細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的成熟[20]。近年來發(fā)現(xiàn)Bregs也可以產生該類細胞因子,Wu等[23]在20例食物過敏患者和20例健康個體的對照研究中發(fā)現(xiàn),在食物過敏組的患者外周血標本中,表達CX3CR1、可以產生TGF-β的B細胞水平明顯低于健康個體組,提示B細胞來源的TGF-β可能在食物過敏的耐受誘導中起關鍵作用。Tordesillas等[24]選擇C3H/HeJ小鼠通過口服或通過皮膚致敏卵清蛋白建立過敏模型,給予表皮或口服途徑進行AIT,采用FMC比較各細胞水平,結果提示過敏小鼠胃腸道因組織缺陷,從頭生成Treg細胞不足,而表皮特異性免疫治療可誘導對過敏反應的持續(xù)保護,提示保護機制是一種新的途徑——直接TGF-β依賴性Treg細胞抑制肥大細胞活化,而這種作用不依賴調節(jié)T 細胞或B 細胞應答。

1.2.3 IL-35 IL-35是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種重要的免疫抑制細胞因子,屬于IL-12細胞因子家族成員,通過誘導調節(jié)性細胞和抑制Th細胞,在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[25]。最初認為該細胞因子僅由Tregs特異性產生,并被發(fā)現(xiàn)有助于Tregs的抑制功能[26]。Shen等[27]發(fā)現(xiàn)B細胞不表達IL-35的小鼠不能從T 細胞介導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎中恢復,且表現(xiàn)出顯著提高的對細胞內細菌病原體鼠傷寒沙門氏菌感染的抗性,提示了產生IL-35的B細胞在免疫調節(jié)中的重要性。

1.2.4 CD1d CD1d是一種多數(shù)Bregs表達的非多態(tài)性主要組織相容性復合體I類抗原呈遞分子,Oleinika等[28]發(fā)現(xiàn),在嵌合小鼠實驗性關節(jié)炎模型中由Bregs表達的CD1d可提呈脂質抗原誘導不變性自然殺傷T 細胞 (invariant NKT,iNKT)細胞分泌干擾素-γ,有助于下調 Th1 和Th17免疫反應和改善實驗性關節(jié)炎癥狀,指出Bregs可通過該途徑抑制過度炎癥。

2 調節(jié)性B細胞在AIT中的研究進展

2.1 Bregs與Tregs Tregs是一類對體內炎癥及自身免疫反應有抑制作用的T 細胞亞群,1995年Sakaguchi等[29]發(fā)現(xiàn)Tregs具有強大的免疫抑制作用,可促進自體免疫耐受并維持免疫系統(tǒng)平衡,它的功能失常與自身免疫性疾病的發(fā)生關系密切[30]。AIT 的目的是誘導和維持無害環(huán)境和自身抗原的免疫耐受,在這一過程中誘導生成Tregs是極為重要的一步[31]。關于Tregs在AIT 中的免疫調節(jié)機制,既往已經研究頗多[5,30],對B 細胞來說,Tregs除了可以產生與之相似的IL-10、TGF-β、IL-35 等細胞因子,還可誘導過敏原特異性Ig G4 和抑制過敏原特異性IgE 的產生。Bregs主要通過分泌細胞因子對Tregs進行調節(jié)。最初主要在貓主人和養(yǎng)蜂人中進行了關于免疫耐受的研究,發(fā)現(xiàn)對變應原健康反應的特征是誘導產生IL-10的Tr1細胞和阻斷型IgG4抗體,而過敏反應為Th2 型細胞及IgE 的過度產生[32]。Suárez-Fueyo等[33]通過對58例成人花粉過敏患者在舌下脫敏治療過程中外周血中細胞因子的變化用流式細胞術進行分析對比后發(fā)現(xiàn),Tregs細胞水平在外周血中明顯增多。Yamanaka等[34]將對柳杉花粉過敏的患者 (29例)分為安慰劑對照組及舌下脫敏治療組,治療組接受預防性舌下脫敏5個月后花粉癥的發(fā)生率明顯下降,而通過流式細胞術分析,提示Tr1 細胞、Br1 細胞在治療組和對照組均增加。Amu等[35]將來自蠕蟲感染的小鼠脾臟產生IL-10的B細胞進行表型分離,轉移至卵清蛋白致敏小鼠,發(fā)現(xiàn)產生IL-10的B 細胞可以通過誘導Tregs細胞,防止卵清蛋白誘導的過敏性氣道炎癥。同樣,Kim 等[36]通過建立牛奶酪蛋白誘導小鼠食物過敏模型,發(fā)現(xiàn)小鼠腸系膜產IL-10的調節(jié)性CD5+B 細胞通過調節(jié)Treg細胞抑制小鼠牛奶酪蛋白誘導的過敏性反應,這種作用是1L-10依賴性的。Liu等[17]通過建立腸道Th2炎癥小鼠模型,用流式細胞術對腸道的一群耐受性B 細胞 (tolerogenic B cells,TolBCs)進行免疫調節(jié)作用分析,發(fā)現(xiàn)該群細胞表達CX3CR1、CD5+、CD19+,可以產生TGF-β,用Th0細胞與TolBCs亞群共培養(yǎng)可產生CD4+CD25+Foxp3+Treg,而TolBCs的過繼轉移則顯著抑制了小鼠食物過敏引起的小腸Th2 模式炎癥。提示該群細胞能夠在小腸中誘導Tregs,同時抑制小鼠食物過敏相關的Th2 模式炎癥。而Shen等發(fā)現(xiàn)Breg產生的IL-35可以誘導Tregs的擴增[27]。

2.2 Bregs與濾泡型輔助性T 細胞 (follicular T helper,Tfh) Tfh是一種CD4+T 細胞,表達B 細胞濾泡歸巢趨化因子受體CXCR5,通過細胞接觸機制 (CD40L、ICOS等)及分泌細胞因子 (IL-21),Tfh誘導和促進抗原特異性B細胞免疫球蛋白的類別轉換及高親和力抗體的產生[37]。目前已知在機體循環(huán)中有3個Tfh細胞亞組：Tfh1、Tfh2和Tfh17。黃璇等[38]選取25 例急性發(fā)作期、20 例緩解期哮喘患者及20例健康對照者作為研究對象,經FMC 檢測外周血中循環(huán)Tfh百分率,ELISA 法檢測血清中總IgE 水平,發(fā)現(xiàn)Tfh 細胞數(shù)量在哮喘患者中明顯增多,尤其是Tfh2細胞,比率 (Tfh2/Tfh1)與血液中總IgE 水平呈正相關。Kamekura等[39]在23例鼻炎患者、19例鼻炎合并哮喘患者和24例健康對照者的外周血標本中,亦發(fā)現(xiàn)有相似的現(xiàn)象,過敏性鼻炎患者外周血標本中的Tfh增多且明顯偏向 Tfh2 細胞,且與Bregs 的減少呈正相關。Coquet等[40]在粉塵螨致敏的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),Tfh 分泌的IL-21促進了肺部的2型炎癥,加強了Th2細胞因子的產生及功能。因此,有理由認為過敏性疾病與Tfh 功能亢進有關。人類T 細胞在IL-12和IL-21存在下多克隆刺激可產生Tfh細胞,Tfh可誘導B細胞最終分化為漿細胞和記憶B細胞。新近Achour等[41]根據(jù)這一基礎進行了人體外細胞培養(yǎng)實驗,純化來源于兒童扁桃腺組織和成人脾臟組織的T、B細胞,用IL-12和IL-21 刺激培養(yǎng)幼稚T 細胞,得到Tfh細胞,同時刺激培養(yǎng)得到Bregs,將二者共同培養(yǎng),采用流式細胞技術和ELISA 檢測該過程中各相關細胞、細胞因子及免疫球蛋白水平,發(fā)現(xiàn)Bregs可抑制Tfh的產生和功能,擴大濾泡調節(jié)性T 細胞 (follicular regulatory T,Tfr)數(shù)量,并抑制Tfh細胞介導的抗體分泌,提示Bregs細胞可以通過調節(jié)Tfh細胞來干擾生發(fā)中心反應,抑制免疫應答。

2.3 Bregs產生的IgG4 在人類B細胞表達IgG 的4個亞類 (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中,IgG4是血清中含量最少的一類,約占B 細胞IgG 總量的4%,但其水平在AIT治療中可高達75%[42],由Br1細胞特異性產生[15]。Br1可通過IL-10介導的抑制作用并將體液應答導向IgG4來促進AIT 期間的變應原耐受,也可特異性地上調IgG4產生[32]。IgG4有一些獨特的特點,使之在免疫耐受中發(fā)揮重要作用：首先IgG4抗體通過具有不同特異性的IgG4分子之間的交換重-輕鏈對來交換Fab臂 (因此可稱其為動態(tài)分子),這導致雙特異性抗體的產生,使之具有顯著降低的交聯(lián)能力;其次IgG4鉸鏈區(qū)的特定結構對某些Fcγ受體親和力較低,并且IgG4不能固定補體;最后,IgG4是阻斷性抗體,其通過與Ig E競爭結合于抗體而阻止效應細胞的活化和脫顆粒[43]。在AIT 期間過敏原特異性IgE 的初期表現(xiàn)為升高,隨后逐漸降低,同時過敏原特異性IgG4抗體則逐漸增加,在連續(xù)使用過敏原的AIT 過程中,血清IgG4 明顯增加,導致過敏原特異性IgE∶IgG4 比例降低,對于AIT,臨床癥狀的改善往往發(fā)生在血清Ig E 降低之前,因此療效并不與特異性IgE 水平的降低相對應。因此,AIT 似乎誘導了保護性免疫應答,而不是通過減少IgE 起作用。只有長期來看,這種保護性免疫機制才可能導致IgE 的減少[30]。雖然在停止AIT 治療1年后,免疫反應性IgG/IgG4水平減少了80%至90%,但IgG 相關的對血清Ig E抑制活性仍會堅持數(shù)年,顯示了持續(xù)的免疫耐受效果[44-46]。

2.4 其他 此外,Bregs還可以通過抑制效應T 細胞增殖和細胞因子的產生來支持AIT。Bregs可以直接抑制效應T細胞,也可以通過分泌IL-10等細胞因子抑制樹突狀細胞間接抑制效應性T 細胞。已經在過敏原耐受性方面進行了研究的人類Bregs子集是Br1 細胞,Wu等[23]收集對比了20例雞蛋過敏患者 (男女比例1∶1)和10例健康成人的外周血標本,采用流式細胞術、ELISA 及實時熒光PCR 等技術,發(fā)現(xiàn)表達CX3CR1 的B 細胞 (Br1)可通過分泌TGF-β有效地抑制抗原特異性效應CD4+T 細胞的增殖。Braza等[47]在屋塵螨誘導過敏性哮喘小鼠模型中,采用轉錄組學和表型分析,發(fā)現(xiàn)過繼轉移小鼠CD9+Breg細胞后可以經IL-10依賴性方式抑制Th2和Th17驅動的炎癥來使氣道炎癥和肺功能正?；?從而恢復肺組織中有利的免疫學平衡。進一步研究顯示,注射CD9+Breg可控制肺效應T 細胞的擴增,從而允許在肺中建立有利的Tregs/效應T 細胞比例。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突