陳 陽，宋良萍，何 宇，陳 瑛，彭 錚

（1 福州市皮膚病防治院整形美容外科，福建 福州,350025；2 福州國際旅行衛(wèi)生保健中心，福建 福州,350001）

糖尿病、創(chuàng)傷感染、動脈供血不足、靜脈回流不暢以及壓迫等因素引起的慢性皮膚潰瘍，是臨床上的常見病、多發(fā)病[1]。流行病學調(diào)查顯示，目前以糖尿病繼發(fā)足部皮膚潰瘍?yōu)樽畛Ｒ?，僅我國就早已有1000萬以上的糖尿病足患者，其中又以老年人居多；因組織再生修復能力差，潰瘍經(jīng)久不愈，或愈后又迅速復發(fā)，形成難愈性潰瘍，其創(chuàng)面修復一直是醫(yī)學上的難題[2,3]。脂肪來源干細胞（adiposederived stem cell，ADSC）是一種具有多項分化潛能的多能干細胞，來源豐富，分離培養(yǎng)容易，自體應用無免疫排斥反應和繼發(fā)傳染病風險，已成為組織工程研究中常用的種子細胞[4-7]。近年的研究表明其對心、肺、皮膚、肌肉等組織創(chuàng)傷具有促進愈合和功能恢復的作用[8,9]。富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）是通過離心分離自體全血而得到的血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長因子，刺激細胞增殖分化及新組織的形成，從而促進創(chuàng)傷的修復和愈合[10-13]。而富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF），是一種富含細胞因子和生長因子的自體來源的新型生物材料，被譽為新一代血小板濃縮物；其分子結(jié)構(gòu)類似天然血凝塊，為組織細胞提供遷移、增殖和分化的場所[14-16]。為此，我們開展PRP、PRF聯(lián)合脂肪來源干細胞治療皮膚潰瘍的實驗研究，以觀察它們對皮膚潰瘍修復的效果，以期為其臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗儀器超凈工作臺(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2235型，LEICA公司)、病理組織漂烘儀(tec 2500型、常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司)、顯微鏡(BX43型，OLYMPUS公司)、移液器(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)、細胞培養(yǎng)皿/細胞培養(yǎng)板(美國Fisher Scientific公司)、低速自動平衡離心機(TDZ4-WS型，湖南湘儀)、臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器公司，型號TGL-16)、臺式低速離心機(上海盧湘儀離心機儀器公司，型號TDZ4-WS)、倒置生物熒光顯微鏡(IX73型,Olympus公司)等。

1.1.2 實驗試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)、SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基、胰酶、I型膠原酶(美國Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、HaCaT細 胞(赫貝公司細胞庫)、纖維蛋白膠(廣州倍繡公司)，Tegaderm(3M公司)，抗體(AnaSpec公司)，蘇木精(sigma公司)，伊紅(sigma公司)，青霉素鈉、青霉素鈉(美侖生物公司)、DAPI、D9542(sigma公司)、細胞角蛋白antibody(proteintech公司)、生理鹽水(辰欣藥業(yè)有限公司)

1.1.3 實驗動物與飼養(yǎng)24只SD大鼠購自上海斯萊克有限公司，SCXK(滬）2017-0005，合格證號：20170005004523。飲用水為超純水。實驗動物房使用許可證號為SYXK(浙)2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對濕度范圍 40～70%。實驗前在動物房適應性喂養(yǎng)一周，飼料由江蘇協(xié)同生物工程有限責任公司提供，執(zhí)行標準 GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs)的分離、培養(yǎng)取8周齡SD大鼠4只，10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，750 ml/L乙醇消毒腹股溝處，無菌條件下取腹股溝部的脂肪組織約5g，去除血管及其它組織，用含青、鏈霉素的PBS反復沖洗以除去血液。用剪刀將脂肪組織剪成1mm3小塊，置于12.5 ml I型膠原酶中，37℃搖床100 r/min消化50 min，然后800r/min離心5 min，棄去上層的脂肪及上清，沉淀物用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，以2×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，原代2 d后換液，細胞長滿80%時用胰酶和EDTA消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 SD大鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs) 體外成表皮誘導分化及免疫熒光鑒定第3代ADSCs細胞，用0.25% Typsin消化，1000rpm離心5min，計數(shù)板下計數(shù)，鋪1個24孔板，選擇4個孔每孔均加入5×104個細胞，分別放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。細胞長滿80%后，兩個孔作為對照正常培養(yǎng)，另兩個孔加入HaCaT細胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合表皮生長因子(EGF)10%作為培養(yǎng)基，2d換一次液，培養(yǎng)一個星期后。吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3×3min，4%多聚甲醛室溫固定20min，PBS洗3×3min，0.1%Triton X-100室溫破膜20min，PBS洗3×3min，10% FBS室溫封閉1h，PBS洗一遍，加入適當稀釋比例的一抗（CK191:300），4℃孵育過夜，PBS洗3×3min，加入適當稀釋比例的熒光二抗Donkey anti-Rabbit IgG (H+L)ReadyProbes? Secondary Antibody（1:800），4℃避光孵育1h，PBS洗3×3min，加入10ng/ml的DAPI，4℃避光孵育10min；PBS洗3×3min，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，完成免疫熒光檢測。

1.2.3 SD大鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs) 體外成脂誘導分化及染色鑒定取第3代ADSCs細胞接種于預先放置玻片的6孔板內(nèi)，用含100 ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，達到80%融合后，用成脂誘導液(含1μmol/L地塞米松、10μmol/L牛胰島素、200 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L的IBMX、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)變化，20 d后用4%多聚甲醛固定，油紅O染色。

1.2.4 SD大鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs) 體外成骨誘導分化及染色鑒定另取第3代ADSCs細胞，細胞培養(yǎng)板中加入成骨誘導液(含50μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L的β-磷酸甘油鈉、0.01μmol/L的維生素D及100ml/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基)培養(yǎng)，3～4 d換液1次。培養(yǎng)10 d時，取部分細胞爬片行I型膠原免疫細胞化學染色。培養(yǎng)21 d時，取部分細胞爬片行von Kossa染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。

1.2.5 SD大鼠脂肪組織來源干細胞(ADSCs)體外成軟骨誘導分化及染色鑒定再取第3代ADSCs細胞，細胞培養(yǎng)板中加入成軟骨誘導液（含10%胎牛血清、10 μg/L TGF-β1、6.25mg/L胰島素、6.25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、50 μmol/L抗壞血酸-2-磷酸酯）培養(yǎng)，每2 d更換1次誘導培養(yǎng)基，21 d后行阿爾辛藍染色，觀察有無藍色結(jié)節(jié)形成。

1.2.6 PRP制備抽取實驗動物SD大鼠靜脈血10ml，枸櫞酸二鈉抗凝，采用改良的Appel法分離提取PRP備用，同時進行全血及PRP血小板計數(shù)，以確保PRP中血小板數(shù)量是全血的4倍以上[17,18]。

1.2.7 PRF制備抽取實驗動物SD大鼠靜脈血10ml，置于無抗凝血酶的無菌試管中，立即將試管以3000r/min離心10min，靜置后，血液樣本分為3層，在位于底層的紅細胞碎片和位于頂層的淡黃色澄清液體血小板血漿之間，取出中間層的淡黃色凝膠，即為富血小板纖維蛋白(PRF)。棄上清，去除凝膠狀物底部的紅細胞部分，獲得初級的PRF凝膠，再將其靜置于干燥消毒的容器內(nèi)10min，使其自然收縮并釋放其內(nèi)的血清，或用無菌紗布吸附血清，同時經(jīng)擠壓塑形制備出具有一定形態(tài)、彈性及韌性的富血小板纖維蛋白膜[19,20]。

1.2.8 動物皮膚潰瘍模型制備及治療SD大鼠麻醉后于其背部脊柱兩側(cè)制作 6個1.5cm×1.5cm大小的全層皮膚缺損潰瘍創(chuàng)面（圖1），并隨機分為A、B、C、D、E、F六組，給藥治療。A組創(chuàng)面注射PRF聯(lián)合ADSCs治療，B組創(chuàng)面注射PRF治療，C組創(chuàng)面注射ADSCs治療，D組創(chuàng)面注射ADSCs聯(lián)合PRP治療，E組創(chuàng)面注射PRP治療，F(xiàn)組創(chuàng)面注射等量生理鹽水(NS)治療。治療后7、14、21、28d潰瘍創(chuàng)面取活檢行組織病理學檢查和觀察潰瘍愈合的速度和質(zhì)量以及比較各自的表皮、真皮、成纖維細胞、血管及皮膚附屬結(jié)構(gòu)的再生情況。

2.實驗結(jié)果

2.1 ADSCs的觀察及多向誘導分化檢測

顯微鏡下ADSCs呈長梭形生長，大小均勻一致，類似成纖維細胞（圖2）。ADSCs細胞在HaCaT細胞培養(yǎng)上清液聯(lián)合表皮生長因子(EGF)的體外誘導后，表皮細胞標志性蛋白細胞角蛋白含量明顯增加，表明細胞誘導成功（圖3）。ADSCs成脂誘導20d，看見細胞內(nèi)充滿圓形脂滴，呈單房或多房，油紅O染色呈橘紅色，說明為成熟脂滴（圖4A）。成骨誘導21d，可見細胞聚集且表面形成不透光結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈紅色，說明鈣結(jié)節(jié)形成（圖4B）。成軟骨誘導21d，可見細胞聚集成團，阿新藍染色呈藍色結(jié)節(jié)，說明有軟骨結(jié)節(jié)形成（圖4C）。提示ADSCs在體外能夠向脂肪、骨、軟骨系細胞分化，有多向分化潛能，具有干細胞特性。

圖1 SD大鼠背部皮膚潰瘍模型

2.1 A、B、C、D、E、F六組動物實驗結(jié)果

各組大鼠創(chuàng)面愈合效果良好，未出現(xiàn)感染等癥狀。7天時已無明顯炎性細胞，傷口被結(jié)締組織增生形成的肉芽組織填滿，其內(nèi)可見新生毛細血管，成纖維細胞等修復細胞；表皮層出現(xiàn)并增厚，逐漸向創(chuàng)口處遷移，再上皮化增生活躍（圖5，圖6）。14天時再上皮化階段完成，肉芽組織被表皮覆蓋，并逐漸纖維化，膠原纖維等含量顯著增加，可見新生的毛囊、皮脂腺、汗腺、角質(zhì)層等附屬結(jié)構(gòu)（圖7，圖8）。21天時，皮膚創(chuàng)面基本愈合，各組愈合速度無明顯差異，同時毛囊、皮脂腺、汗腺、角質(zhì)層等附屬結(jié)構(gòu)增多，肉芽組織逐漸向瘢痕組織轉(zhuǎn)化，并進入組織重塑期（圖9，圖10）。28天與21天比較無明顯變化，組織進入漫長重塑期（圖11，圖12）。愈合狀況：D組（ADSC+PRP組）、A組（ADSC+PRF組）和C組（ADSC組）表皮較完整，血管新生明顯增多，以D組最明顯，A、C、E、B組依次，F(xiàn)組表皮遷移速度最慢，血管相對較少；新生毛囊明顯增多，以D組最明顯，A、C、E、B組依次，F(xiàn)組最少。

愈合速度與質(zhì)量大致為ADSC+PRP＞ADSC+PRF＞ADSC＞PRP＞PRF＞NS。

圖2 ADSCs呈梭形（×40）

3 討論

創(chuàng)面愈合是一個復雜而有序的生物學過程，呈現(xiàn)高度的整體性和網(wǎng)絡(luò)性，在 機體的調(diào)控下，炎性細胞、修復細胞、細胞外基質(zhì)及細胞因子等多因素相互協(xié)調(diào)，共同參與創(chuàng)面愈合[21]。一般認為創(chuàng)面修復緩慢甚至修復停止的原因主要有以下4種：①傷口感染或壞死組織存在；②傷口血供微循環(huán)障礙；③局部生長因子數(shù)量 減少，活性降低或多種生長因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失控；④修復細胞支架改變和過度凋亡，細胞膜上受體結(jié)構(gòu)變化，導致生長因子與受體之間失偶聯(lián)[22]。因此，移植補充新鮮的創(chuàng)面修復細胞和有活性的生長因子成為目前慢性潰瘍創(chuàng)面修復領(lǐng)域研究的重點和熱點。ADSC是存在于脂肪組織中的一類成體干細胞，具有來源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小、體外分離培養(yǎng)容易、可塑性強、自體應用無免疫排斥反應和繼發(fā)傳染病風險等優(yōu)勢，已成為再生醫(yī)學研究中很有前途的種子細胞[23]。本研究觀察到ADSC對創(chuàng)面愈合具有一定的促進作用，推測這可能與干細胞具有補充和分化成為皮膚潰瘍創(chuàng)面修復所需的多系細胞密切相關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)ADSC具有改善皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合質(zhì)量的作用，使創(chuàng)面肉芽組織中成纖維細胞增多，功 能旺盛，血管密度提高，形成的新生表皮較完整、更厚。

圖3 ADSCs成表皮細胞誘導分化及鑒定

圖4 ADSCs成脂、成骨和成軟骨誘導分化及鑒定

圖5 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療7天創(chuàng)面大體愈合情況

圖6 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療7天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖7 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療14天創(chuàng)面大體愈合情況

圖8 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療14天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖9 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療21天創(chuàng)面大體愈合情況

圖10 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療21天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

圖11 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療28天創(chuàng)面大體愈合情況

圖12 六組SD大鼠背部皮膚潰瘍治療28天創(chuàng)面病理活檢切片光鏡下所見

PRP是血小板濃縮物，經(jīng)激活后能釋放出大量高濃度的生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形成蛋白(BMPs)、血小板衍生生長因子(PDGF)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等[24]，這些生長因子具有誘導表皮細胞遷移、增殖、分化和促進第三、第四型的膠原蛋白有效增生的作用，從而促進創(chuàng)面的愈合。而且真皮干細胞增殖、分化，與血小板的濃度有直接正關(guān)聯(lián)性，血漿濃度達到正常血小板濃度的4～5倍時，在優(yōu)良的環(huán)境下，才會引起細胞的增殖與分化[25]。

目前研究證明，PRF富含的多種生長因子可協(xié)同作用，促進Ⅰ型膠原及纖連蛋白的合成，促進基質(zhì)干細胞的趨化及增殖，刺激成纖維細胞及血管內(nèi)皮的分化增殖在組織愈合過程中起重要調(diào)控作用[26]；PRF的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)作為基質(zhì)，為細胞的附著、遷移以及分化提供了有利的場所，使組織細胞及循環(huán)血中的干細胞能更快的長入其中，且這種結(jié)構(gòu)彈性好，孔隙大，利于營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣的彌散，加速愈合過程[27]；大量的滯納的血小板及生長因子與纖維蛋白發(fā)生化學鍵結(jié)合，這種特殊的結(jié)構(gòu)與多種生長因子有較強的親和力，從而使生長因子緩慢釋放，延長PRF在創(chuàng)口的作用時間[28]；也有研究表明，PRF的立體結(jié)構(gòu)可以滯納大部分白細胞，調(diào)節(jié)炎癥反應，并使多種細胞因子緩慢持續(xù)釋放，對于組織修復產(chǎn)生積極效果[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，單純的ADSC或單純的PRP、PRF對創(chuàng)面愈合也有一定的促進作用，但效果不如兩者聯(lián)合應用。其原因可能是，在創(chuàng)面愈合過程中，ADSC起到種子細胞的作用，在機體內(nèi)環(huán)境的誘導作用下向組織細胞分化，而PRP起到營養(yǎng)的作用，同時，PRP中各種高濃度有活性的生長因子可促進ADSC的增殖分化，增加修復細胞數(shù)量，這些修復細胞通過旁分泌和自分泌形式分泌生長因子又可以作用于周圍細胞及細胞自身；而PRF的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)則作為基質(zhì)，為細胞的附著、遷移以及分化提供了有利的場所，從而構(gòu)成了一個良性循環(huán)，各自聯(lián)合起到協(xié)同修復的效果，促進創(chuàng)面的愈合和改善愈合質(zhì)量。另外，本研究發(fā)現(xiàn)愈合速度與質(zhì)量大致為ADSC+PRP＞ADSC+PRF＞ADSC＞PRP＞PRF＞NS，推測ADSC在皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合中發(fā)揮的作用大于PRP和PRF，而RPR的作用又大于PRF，其具體分子機制仍有待進一步研究。