冉燕翠，楊翠紅，鄭春燕，孫秀威

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，哈爾濱1500810

膽囊癌是最常見的惡性膽道腫瘤，在世界范圍內(nèi)占惡性膽道腫瘤的80%～95%[1-2]，其發(fā)病隱匿，早期診斷率僅為19.1%，惡性程度高，預(yù)后差，總體5年生存率低于5%，中位生存期＜6個月[3]。目前手術(shù)治療仍然是治愈原發(fā)性膽囊癌的唯一方法，但僅有20%～30%的患者能夠獲得根治性切除。研究表明，炎癥與腫瘤之間關(guān)系密切，是誘發(fā)膽囊癌的重要因素[4]。90%的成人血清中可檢測到EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）抗體，全球1%的惡性腫瘤與EBV有關(guān)[5]。本文就EBV與膽囊癌的關(guān)系作一綜述。

1 EB V

1964年，Epstein和Barr通過電子顯微鏡在Burkitt淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了第一種與人類腫瘤相關(guān)的病毒——EBV。EBV又稱人類皰疹病毒4型，屬于皰疹病毒科的γ亞科，形態(tài)與其他皰疹病毒相似，圓形，直徑180 nm，基本結(jié)構(gòu)含核樣物、衣殼和囊膜三部分。核樣物為直徑45 nm的致密物，主要含長度約為172 kb的雙鏈DNA，分子量為108。EBV通過唾液傳播在成人人群中普遍存在，人群感染率高達90%，主要感染B淋巴細胞和上皮細胞，以潛伏期和裂解期兩種形式存在于宿主細胞中[6]。EBV在宿主細胞中潛伏感染，干擾機體的免疫功能，刺激細胞增殖和轉(zhuǎn)化并致癌。目前，已有研究證實EBV與傳染性單核細胞增多癥[7]、Burkitt淋巴瘤[8]、霍奇金淋巴瘤[9]、NK/T 細胞淋巴瘤[10]、鼻咽癌[11]、胃癌[12]、子宮頸癌[13]、甲狀腺腫瘤[14]等的發(fā)生有關(guān)。

2 EBV的致癌機制

EBV基因組是一條長度約為172 kb的雙鏈DNA，其通過EBV膜蛋白gp350與淋巴細胞受體CD21和人類白細胞抗原Ⅱ（human leukocyte antigenⅡ，HLAⅡ）相互作用進入B淋巴細胞。通過上皮細胞膜受體分子神經(jīng)菌毛素1（neuropilin 1，NRP1）與病毒糖蛋白gB的C端（C-end rule，CendR）特殊結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，使得EBV以巨胞飲和脂筏依賴的內(nèi)吞機制進入上皮細胞，實現(xiàn)對宿主細胞的感染，并激活NRP1依賴的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路。EBV還可直接與感染的B淋巴細胞接觸進入上皮細胞。在原發(fā)感染時，EBV在上皮細胞或B淋巴細胞中復(fù)制，然后為了逃避免疫監(jiān)視，關(guān)閉大部分基因并進入潛伏期，以靜息記憶B淋巴細胞為主要宿主[6]。潛伏感染時EBV基因主要表達6種核抗原（Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA）（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和EBNALP）、3種潛伏膜 蛋 白（latent membrane protein，LMP）（LMP1、LMP2A和LMP2B）、2種EBV編碼的小RNA（EBER1和EBER2）和2組微小RNA（microRNA，miRNA）（BHRF1、BART）。

2.1 EBNA 1

EBNA1是唯一一種在所有EBV相關(guān)惡性腫瘤中都表達的病毒蛋白[12]。EBNA1基因是EBV基因組復(fù)制和維持的關(guān)鍵，可能是致癌基因，可改變細胞環(huán)境并促使基因組不穩(wěn)定。此外，EBNA1還可通過下調(diào)癌基因myc的表達，增強抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和存活蛋白（survivin）的表達，抑制細胞凋亡，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，導(dǎo)致染色體畸變[15]。

2.2 EBNA 2

EBNA2對促進轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞增殖和防止轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞凋亡具有重要意義，EBNA2還可與EBNA3C聯(lián)合，激活LMP1啟動子。已有研究證實EBNA2的表達與腫瘤發(fā)生有關(guān)[16]。

2.3 EBNA 3

EBNA3的作用是抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的積累，降低抑癌基因人視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）基因的表達，穩(wěn)定癌基因c-myc的表達，并抑制促凋亡蛋白BIM的表達[17]。

2.4 LMP 1

LMP1是由BNLF1基因編碼的一種跨膜病毒蛋白，是EBV的主要致癌蛋白，是將靜止的原代B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為增殖性淋巴母細胞所必需的蛋白。LMP1是一種組成性激活的CD40受體，可激活參與記憶B淋巴細胞分化和抗凋亡蛋白表達的下游信號通路，這些下游信號通路包括核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK、磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、Notch和JAK激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）[18]。

2.5 LMP 2

LMP2是一種親水性膜蛋白，由于起始轉(zhuǎn)錄的啟動子不同而形成兩種不同的表達產(chǎn)物L(fēng)MP2A和LMP2B。研究表明，LMP2B能夠促進上皮細胞的擴散，增強其能動性[19]。LMP2A能夠通過抑制轉(zhuǎn)化 生長 因 子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，激活NF-κB信號通路，上調(diào)survivin及細胞周期蛋白E（cyclin E）的表達，促進細胞進入S期，從而促進細胞增殖[20-22]。

2.6 miRNA

EBV編碼的miRNA是一種非編碼RNA，在EBV感染的細胞中大量表達，其在病毒感染、細胞凋亡、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。研究表明，促凋亡蛋白（如BIM）[23]、凋亡相關(guān)基因受體（如Bax受體TOM22）[23]、Bcl-2基因[24]、凋亡終末剪切酶胱天蛋白酶3（caspase 3）[25]是miRNA的直接靶點，可抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞生長。miRNA可通過抑制抑癌基因PTEN的表達和調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[26-28]。此外，miRNA還通過激活白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路，下調(diào)細胞周期依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達，促進耐藥[29]。

3 EBV與膽囊癌

段建峰等[30]研究表明，35例膽囊癌患者中，EBV感染患者16例（45.7%）；35例膽囊良性疾病患者中，EBV感染患者3例（8.6%）。膽囊癌患者EBV感染的發(fā)生率高于膽囊良性疾病患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示膽囊癌與EBV感染有關(guān)，且膽囊癌和膽囊良性疾病患者EBV感染的發(fā)生率不同，為臨床診斷及治療提供了理論基礎(chǔ)。

4 以EBV為靶點的治療

在大部分EBV相關(guān)惡性腫瘤中，幾乎所有的腫瘤細胞內(nèi)都包含病毒基因組，同時，宿主體內(nèi)其他部位存在的EBV陽性非腫瘤細胞數(shù)量非常少，使得以EBV基因組為靶點治療EBV相關(guān)惡性腫瘤成為可能。目前抗EBV治療的方法主要包括藥物治療、免疫治療和病毒靶向治療。

4.1 藥物治療

目前常用的抗皰疹病毒藥物主要是嘌呤核苷類似物，如阿昔洛韋（acyclovir，ACV）、更昔洛韋（ganciclovir，GCV）和伐昔洛韋（famcyclovir，F(xiàn)CV），它們是抗病毒前體藥物。EBV在腫瘤細胞中保持潛伏感染，這些腫瘤細胞對抗皰疹病毒前體藥物不敏感。在丁酸等裂解期基因表達誘導(dǎo)劑的存在下，潛伏的EBV表達激酶，將前體藥物轉(zhuǎn)化為有活性的形式，如單磷酸化更昔洛韋（ganciclovir monophosphate，GCV-p），在病毒DNA復(fù)制時，三磷酸化更昔洛韋（ganciclovir triphosphate，GCV-TP）可以競爭性地結(jié)合到病毒DNA鏈上，使聚合酶鏈反應(yīng)終止，細胞周期停滯，最終導(dǎo)致被EBV感染的細胞凋亡[31]。

4.2 免疫治療

隨著研究者對EBV相關(guān)惡性腫瘤發(fā)生機制的不斷探索，免疫治療成為EBV相關(guān)惡性腫瘤治療的新方向。腫瘤免疫治療包括腫瘤疫苗、過繼性免疫治療、免疫檢查點抑制劑等。

4.2.1 腫瘤疫苗 腫瘤疫苗是指用無致瘤性但有抗原性的瘤苗誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的一種主動免疫，包括預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。1976年Epstein[32]首先提出采用疫苗預(yù)防EBV相關(guān)惡性腫瘤或降低其發(fā)病率。目前大多數(shù)研制預(yù)防性疫苗的工作都集中在EBV gp350上，因為EBV通過gp350與CD21結(jié)合感染細胞，同時gp350是EBV和被感染細胞中最豐富的糖蛋白，也是產(chǎn)生中和性抗體抵御病毒感染的首要靶標[33]。一項Ⅰ/Ⅱ期臨床研究表明，應(yīng)用病毒糖蛋白gp350重組體制作的EBV疫苗可誘導(dǎo)人類產(chǎn)生中和抗體[34]。Sokal等[35]研究表明，疫苗能夠減少與EBV相關(guān)的疾病的發(fā)生，但不一定能預(yù)防感染。治療性疫苗的作用是誘導(dǎo)細胞免疫。輸注EBV特異性T淋巴細胞可延長霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌患者的生存期，這為治療性疫苗的應(yīng)用提供了證據(jù)。Smith等[36]應(yīng)用EBV特異性自體T淋巴細胞治療鼻咽癌轉(zhuǎn)移患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受細胞治療患者的中位總生存期明顯長于未接受細胞治療的患者。另有一項研究納入35例鼻咽癌患者，所有患者均接受化療和EBV特異性細胞毒性T淋巴細胞（Epstein-Barr virus specific cytotoxic T lymphocyte，EBV-CTL）治療，其有效率為71%，2年和3年生存率分別為63%和37%[37]。因此，一種能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生EBV特異性T淋巴細胞的疫苗可能會提高EBV相關(guān)腫瘤患者的生存率。由此推測，EBV疫苗可能在EBV陽性膽囊癌患者的預(yù)防與治療中具有重要作用。

4.2.2 過繼性免疫治療過繼性免疫治療是指從腫瘤患者體內(nèi)分離出有活性的免疫細胞，在體外經(jīng)篩選及擴增后誘導(dǎo)產(chǎn)生高度特異性的具有抗腫瘤活性的免疫細胞，再將其回輸給患者，從而達到治療腫瘤的目的。EBV相關(guān)惡性腫瘤中可表達EBNA、LMP、EBER等病毒蛋白，它們均可作為EBV-CTL治療的靶抗原，且EBV-CTL的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)得到證實[38]。假設(shè)部分膽囊癌與EBV的感染有關(guān)，應(yīng)用EBV-CTL治療膽囊癌理論上會取得一定的療效。但目前國內(nèi)外相關(guān)報道較為罕見，需經(jīng)研究證實。

4.2.3 免疫檢查點抑制劑免疫治療是最近十年針對腫瘤治療的重大突破之一。免疫治療的目的在于發(fā)生免疫反應(yīng)時，機體能保持自我耐受和防止組織受損。腫瘤細胞可利用免疫檢查點的激活來逃避免疫監(jiān)視。通過封鎖免疫檢查點，重建正常的抗腫瘤免疫系統(tǒng)是一種新型、有前景的治療腫瘤的方法[39]。目前的研究中效果最顯著的是細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4）、程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱PD-1）及程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）免疫檢查點，免疫檢查點抑制劑能重新激活抗腫瘤免疫，促進腫瘤消退。許多臨床試驗結(jié)果表明，在實體腫瘤中利用免疫檢查點抑制劑阻斷CTLA4/PD-1/PD-L1信號通路可以獲得良好的療效和安全性[40-43]。目前CTLA4單克隆抗體伊匹單抗（ipilimumab）已被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，PD-1抑制劑派姆單抗（pembrolizumab）和納武單抗（nivolumab）已被FDA批準用于治療晚期黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性肺鱗癌。研究表明，EBV感染的鼻咽癌患者腫瘤組織中CTLA4、PD-1及PD-L1的表達水平均明顯高于非腫瘤組織，且與患者預(yù)后有關(guān)[44]。目前尚不清楚CTLA4、PD-1及PD-L1在EBV相關(guān)的膽囊癌中的表達情況，有待進行此方面的研究。

4.3 病毒靶向治療

在大多數(shù)EBV相關(guān)惡性腫瘤中，絕大部分腫瘤細胞都含有病毒基因組，而在正常組織中EBV感染率極低，這種腫瘤特異性為研究治療策略提供了理論依據(jù)。在EBV感染的裂解階段，EBV感染的細胞中胸苷酸激酶可將前體藥物GCV轉(zhuǎn)化為有活性的細胞毒性形式。活性GCV可干擾病毒和宿主DNA聚合酶的合成，導(dǎo)致腫瘤細胞DNA復(fù)制的終止，誘導(dǎo)細胞凋亡，這使得EBV暴露于宿主免疫監(jiān)測中，并且磷酸化的GCV可以轉(zhuǎn)移到相鄰的細胞中，從而誘導(dǎo)其他EBV陽性腫瘤細胞的凋亡[45]。因此，在EBV陽性的腫瘤細胞中，誘導(dǎo)EBV進入裂解周期可能成為治療EBV相關(guān)腫瘤的一種新方法。目前，佛波酯（如TPA）、丁酸鈉（sodium butyrate，SB）[46]、曲古抑菌素 A（trichostatin A，TSA）[47]、5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）[48]是誘導(dǎo)EBV裂解基因表達的常用藥物。TPA是蛋白激酶C的激動劑，可促進BZLF1和BRLF1基因轉(zhuǎn)錄因子的激活[49]，表觀遺傳抑制劑（如SB、TSA和5-aza）可以在BZLF1和BRLF1基因的啟動子處打開染色質(zhì)，TPA與表觀遺傳抑制劑聯(lián)合使用可誘導(dǎo)EBV進入裂解周期。特定的抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)EBV裂解復(fù)制，并使腫瘤細胞對核苷類抗病毒藥物敏感。亞色胺苯胺羥肟酸是一種組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑 ，可通過干擾BZLF1和BRLF1基因沉默促進EBV的重新激活，從而促進轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核，而GCV增強了其在體外和荷瘤裸鼠體內(nèi)殺死EBV陽性淋巴瘤細胞的能力[50-51]。部分凋亡誘導(dǎo)劑如吉西他濱、多柔比星、依托泊苷和淫羊藿苷，可誘導(dǎo)EBV的重新激活，吉西他濱和多柔比星可激活BZLF1和BRLF1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄。另外，PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路也參與了誘導(dǎo)EBV的裂解和復(fù)制。研究表明，依托泊苷可引起Akata細胞中EBV的重新激活[52]。另有研究表明，淫羊藿苷可通過抑制LMP1介導(dǎo)的AKT/STAT3信號通路，誘導(dǎo)EBV裂解基因的表達[53]。研究表明，利妥昔單抗和地塞米松聯(lián)合作用于EBV陽性和CD20陽性的淋巴瘤細胞時，EBV早期抗原的表達量明顯增加，可以誘導(dǎo)EBV從潛伏期進入裂解期，然后聯(lián)合抗皰疹病毒藥物（如GCV），可以達到較好的抗腫瘤效果[54]。Tikhmyanova等[55]在66 840個小分子化合物中發(fā)現(xiàn)了5種四氫咔唑衍生物，被稱為C09、C50、C53、C60、C67，它們能夠有效地激活各種類型細胞中潛在的EBV，這5種化合物與GCV聯(lián)合應(yīng)用顯示了病毒靶向治療的前景。Choi等[56]對50 240種小分子有機化合物進行了高通量篩選，以確定EBV陽性上皮惡性腫瘤中EBV裂解周期的最強誘導(dǎo)劑。因此，誘導(dǎo)EBV裂解藥物聯(lián)合抗皰疹病毒藥物（如GCV）的應(yīng)用已被認為是治療EBV陽性腫瘤的一種新策略，這為EBV相關(guān)性膽囊癌的治療提供了一個新的治療思路。目前國內(nèi)有關(guān)病毒靶向治療與EBV相關(guān)性膽囊癌的研究尚不多見，需要大量研究證實。

5 小結(jié)與展望

EBV相關(guān)惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)一個重要的健康問題，在東南亞和中國的發(fā)病率較高。膽囊癌是最常見的惡性膽道腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后差。目前國內(nèi)外有關(guān)EBV與膽囊癌關(guān)系的研究較少，只證實部分膽囊癌患者存在EBV感染，但EBV是獨立的致癌因素，還是在其他高危致癌因素下促進腫瘤的發(fā)生，以及其具體的致癌機制尚待深入研究。免疫治療及病毒靶向治療在EBV相關(guān)惡性腫瘤的治療中具有較好的前景，也許能為膽囊癌的治療提供新的思路，從而提高患者的生存率，改善患者的生活質(zhì)量。