閆佰鵬，王芳彬，李成海，周文靜，李發(fā)弟,4，李 飛

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局，甘肅 蘭州 730070；3. 金昌居佳生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，甘肅 金昌 737100；4. 甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤 733300）

秸稈資源的合理、高效利用對國民生產(chǎn)意義重大，其具有可再生、分布廣、數(shù)量多、低污染等特點(diǎn)，已成為可持續(xù)發(fā)展的支柱能源之一[1]。據(jù)報(bào)道，全球14%的能源是由農(nóng)作物秸稈產(chǎn)生[2]，同時(shí)秸稈也是反芻動(dòng)物主要的粗飼料來源，并為反芻動(dòng)物瘤胃微生物和自身供能[3]。我國秸稈資源豐富，油菜秸稈占秸稈總量的4.2%[4]，其粗蛋白(crude protein, CP)含量優(yōu)于同地區(qū)種植玉米(Zea mays)秸稈、小麥(Triticum aestivum)秸稈與大豆(Glycine max)秸稈[5]。劉建勝[6]研究表明，與常規(guī)作物秸稈相比，油菜秸稈用作反芻動(dòng)物飼料的比例僅為13.0%，約40%的油菜秸稈被用作燃料，造成了油菜秸稈的嚴(yán)重浪費(fèi)。張勇等[7]用油菜秸稈型顆粒飼糧飼喂6月齡湖羊，結(jié)果表明，油菜秸稈型顆粒飼糧對湖羊健康無不良影響，同時(shí)可降低飼料成本，增加養(yǎng)殖效益；張吉鹍等[8]利用飼料分級指數(shù) (GI)方法對花生 (Arachis hypogaea)藤、紅薯(Dioscorea esculenta)藤與油菜秸稈等粗飼料進(jìn)行評定，研究發(fā)現(xiàn)油菜秸稈 (GI = 0.30)低于花生藤 (GI =1.48)與紅薯藤 (GI = 1.65)，但高于測定的玉米秸稈(GI = 0.20)和谷草 (GI = 0.17)，表明油菜秸稈是一種具有開發(fā)潛力的粗飼料，可作為反芻動(dòng)物粗飼料來源。因此，評價(jià)油菜秸稈營養(yǎng)價(jià)值對反芻動(dòng)物精準(zhǔn)飼養(yǎng)、合理利用資源、優(yōu)化飼糧配方具有生產(chǎn)實(shí)踐意義。

NIRS (near-infrared reflectance spectroscopy)技術(shù)是20世紀(jì)70年代新興發(fā)展的一種快速、精確、非破壞性分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于飼料原料營養(yǎng)成分分析[9]。飼料原料成分對近紅外光譜具有不同吸收程度進(jìn)而得到不同的近紅外光譜。近紅外光譜技術(shù)通過主成分分析 (priciple component analysis,PCA)、偏最小二乘法 (partial least square, PLS)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (artificial neural network, ANN)等現(xiàn)代分析手段，建立物質(zhì)光譜與待測成分含量間的線性或非線性模型，從而實(shí)現(xiàn)用物質(zhì)近紅外光譜信息對待測成分含量的快速計(jì)算[10]。目前，國內(nèi)NIRS技術(shù)在粗飼料方面應(yīng)用范圍非常廣泛，但主要集中在玉米秸稈、水稻(Oryza sativa)秸稈、小麥秸稈等常規(guī)粗飼料資源。油菜是我國的主要油料作物之一，在我國長江流域、東北地區(qū)和西北地區(qū)廣泛種植，秸稈年產(chǎn)量達(dá)到4千萬t[11]，秸稈資源豐富。但對于油菜秸稈資源利用效率低下、利用方式單一與基礎(chǔ)研究較少是限制油菜秸稈利用的主要限制因素。因此，本研究旨在利用NIRS對油菜秸稈的營養(yǎng)成分建立定標(biāo)模型，通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證與外部驗(yàn)證，預(yù)測NIRS技術(shù)對油菜秸稈營養(yǎng)價(jià)值評定的可行性，為生產(chǎn)實(shí)踐快速評定油菜秸稈的營養(yǎng)價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

本研究共采集油菜秸稈樣品125份，油菜秸稈樣品分布信息與采樣份數(shù)如表1所列。選取具有代表性、無霉變、質(zhì)量為1.5～2.0 kg的整株脫籽油菜秸稈樣品。將采集到的整株油菜秸稈樣品鍘至3～5 cm段，利用粉碎機(jī)(中型粉碎機(jī)F220)進(jìn)行粉碎，過0.425 mm飼料分析篩后將樣品混合均勻，裝入自封袋密封保存、備用。

表1 油菜秸稈樣品分布信息與采樣份數(shù)Table 1 Distribution information and sample number of rape straw samples

1.2 油菜秸稈NIRS預(yù)測模型的建立

1.2.1 近紅外光譜圖的采集

試驗(yàn)采用NIRS 5000(丹麥，F(xiàn)OSS)近紅外光譜分析儀對油菜秸稈進(jìn)行近紅外光譜的采集，利用配套的WinISI Ⅲ軟件進(jìn)行近紅外預(yù)測模型的建立與驗(yàn)證。采集光譜時(shí)每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，最后取平均值得到平均光譜圖譜。

1.2.2 模型建立與驗(yàn)證

使用近紅外光譜分析儀配套的WinISI Ⅲ軟件進(jìn)行儀器操作及光譜數(shù)據(jù)和參比數(shù)據(jù)分析，并對各個(gè)養(yǎng)分進(jìn)行定標(biāo)模型構(gòu)建。樣品按照4∶1的比例，隨機(jī)分成定標(biāo)集 (N = 100)和驗(yàn)證集 (N = 25)，分別用于定標(biāo)模型的建立和外部驗(yàn)證。本研究在進(jìn)行回歸技術(shù)選擇時(shí)，選擇改進(jìn)最小二乘法回歸技術(shù)進(jìn)行油菜秸稈近紅外模型的建立。在定標(biāo)過程中，為了消除無關(guān)信息與噪聲對試驗(yàn)的干擾，利用7種去散射處理和3種導(dǎo)數(shù)處理對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。模型建立過程中，根據(jù)軟件建議值分別設(shè)置相應(yīng)窗口，交叉驗(yàn)證 (cross validation groups)分組數(shù)目窗口建議值為5，超常樣品刪除批次 (number of outlier elimination passes)窗口建議值為 2，缺省數(shù) (missing date value)據(jù)默認(rèn)窗口建議值為 0，T 值超 常 樣 品 (critical T outlier)窗 口 ， 確 認(rèn) 顯 示 值 為2.5，其表示當(dāng)建立定標(biāo)模型后利用此模型預(yù)測定標(biāo)樣品集。若預(yù)測結(jié)果與傳統(tǒng)化學(xué)測定結(jié)果的差大于該定標(biāo)誤差的2.5倍，則被認(rèn)為是T值超常樣品。H 值超常樣品 (critical H outlier)窗口，確認(rèn)顯示值為10，其定義為若樣品的GH值大于10(或某樣品的偏差大于定標(biāo)樣品集平均偏差10倍)，則將被認(rèn)為是光譜值超常樣品，進(jìn)行剔除。

1.2.3 近紅外光譜評價(jià)參數(shù)

油菜秸稈定標(biāo)模型建立時(shí)，以Modified PLS與不同光譜處理方法及參數(shù)進(jìn)行搭配組合進(jìn)行油菜秸稈近紅外模型的建立，并且通過內(nèi)部與外部驗(yàn)證來比較模型預(yù)測值與實(shí)際測定值之間的偏離程度。定標(biāo)模型建立后，用交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(1 minus the variance ration, 1-VR)、 交 叉 驗(yàn) 證 誤 差 (standard error of cross validation, SECV)和分析值與預(yù)測值的標(biāo)準(zhǔn)偏差 (standard error of calibration, SEC)3 個(gè)指標(biāo)來作為定標(biāo)模型優(yōu)劣選擇的指標(biāo)。若預(yù)測模型的1-VR值越接近1，即為最佳模型；SECV可以大致評估定標(biāo)模型預(yù)測的準(zhǔn)確度，其值越小越有利于最佳模型的挑選。SEC表示分析值與預(yù)測值之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對驗(yàn)證集評價(jià)的指標(biāo)主要有定標(biāo)相關(guān)系數(shù)(R squared，RSQ)、Bias為測定值與預(yù)測值之間的平均偏差和SEP即驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)分析誤差3個(gè)指標(biāo)。當(dāng)RSQ值較大而Bias值較小時(shí)，即為最佳模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜秸稈樣品近紅外光譜圖

根據(jù)125份油菜秸稈樣品掃描所得近紅外原始光譜圖 (圖1)可知，油菜秸稈樣品在整個(gè)光譜范圍內(nèi)各波長處具有不同的吸收特點(diǎn)，在1 450 cm-1和1 799 ～2 149 cm-1吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，有強(qiáng)烈的吸收峰。為了消除光譜掃描包含的背景信息、噪聲信息及基線漂移帶來的影響，提高光譜分辨率，清楚地表明光譜的變化，圖2與圖3分別為油菜秸稈樣品經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理和二階導(dǎo)數(shù)處理的原始光譜圖。

圖1 125份油菜秸稈樣品近紅外光譜圖Figure 1 The original near infrared spectrum of 125 rape straw samples

圖2 125份油菜秸稈樣品一階導(dǎo)數(shù)處理光譜圖Figure 2 First derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

圖3 125份油菜秸稈樣品二階導(dǎo)數(shù)處理光譜圖Figure 3 Second derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

2.2 油菜秸稈營養(yǎng)成分近紅外模型建立

2.2.1 油菜秸稈營養(yǎng)成分

油菜秸稈樣品中DM含量變化范圍為91.20%～96.39%，平均值為93.62%；CP含量變化范圍為2.06%～15.92%，平均值為5.85%；NDF含量變化范圍為50.51%～82.12%，平均值為67.22%；ADF含量變化范圍為41.44%～65.38%，平均值為55.40%；Ash含量變化范圍為4.12%～12.46%，平均值為7.66%；EE含量變化范圍為0.27%～9.84%，平均值為2.57%；NDIP含量變化范圍為0.50%～2.10%，平均值為1.04%；ADIP含量變化范圍為0.26%～1.70%，平均值為0.63%；ADL含量變化范圍為6.73%～22.33%，平均值為13.58%；NPN含量變化范圍為0.01%～6.04%，平均值為1.70%；SP含量變化范圍為0.46%～10.17%，平均值為2.89%(表2)。

2.2.2 不同處理方法油菜秸稈樣品近紅外模型選擇

油菜秸稈各營養(yǎng)成分指標(biāo)的最優(yōu)組合分別為：DM 為Standard MSC 和 1，4，4，1；CP 為Weighted MSC 和 2，4，4，1；NDF 為 SNV 和 2，4，4，1；ADF為 Detrend和 2， 4， 4， 1； EE為 Inverse MSC 和 2， 4， 4， 1； Ash為 SNV and Detrend和1，4，4，1；NDIP 為 Weighted MSC 和 2，4，4，1； ADIP為 Detrend和 1， 4， 4， 1； ADL 為SNV 和 2，4，4，1；NPN 為 Weighted MSC 和 1，4，4，1；SP 為 Weighted MSC 和 1，4，4，1(表 3)。各營養(yǎng)成分指標(biāo)所對應(yīng)的SECV和1-VR值分別為：DM 為0.326 2 和0.912 0，CP 為0.325 2 和0.990 8，NDF 為 1.762 5 和 0.900 4，ADF 為 3.856 6 和 0.709 8，EE 為 0.352 5 和 0.974 2，Ash 為 0.471 3 和 0.913 5，NDIP 為0.239 6 和0.442 7，ADIP 為0.122 1 和0.675 9，ADL 為 1.498 6 和 0.458 2，NPN 為 0.377 5 和 0.924 6，SP 為 0.612 8 和 0.928 5。

表2 油菜秸稈營養(yǎng)成分Table 2 The nutrient content of rape straw

表3 油菜秸稈各營養(yǎng)成分指標(biāo)最佳定標(biāo)模型Table 3 Optimal NIRS prediction models for nutrition index of rape straw

2.3 油菜秸稈營養(yǎng)成分近紅外模型的驗(yàn)證

2.3.1 驗(yàn)證集油菜秸稈樣品營養(yǎng)成分

油菜秸稈驗(yàn)證集所用樣品數(shù)為25份。用于外部驗(yàn)證的油菜秸稈樣品各營養(yǎng)成分的含量，DM含量變化范圍為91.82%～95.92%，平均值為93.62%；CP含量變化范圍為2.26%～11.00%，平均值為5.54%；NDF含量變化范圍為54.55%～78.52%，平均值為70.47%；ADF含量變化范圍為39.76%～65.30%，平均值為56.00%；Ash含量變化范圍為4.91%～9.50%，平均值為7.28%；EE含量變化范圍為0.46%～6.06%，平均值為2.27%；NDIP含量變化范圍為0.67%～1.88%，平均值為1.02%；ADIP含量變化范圍為0.19%～1.29%，平均值為0.64%；ADL含量變化范圍為10.39%～18.92%，平均值為13.62%；NPN含量變化范圍為0.36%～4.59%，平均值為1.34%；SP含量變化范圍為0.64%～6.86%，平均值為2.53% (表4)。

2.3.2 油菜秸稈各營養(yǎng)成分最佳模型驗(yàn)證結(jié)果

油菜秸稈 DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash、NDIP、ADIP、ADL、NPN和SP成分的最佳定標(biāo)模型內(nèi)部驗(yàn)證RSQ值分別為0.901、0.938、0.586、0.710、0.922、0.788、0.392、0.580、0.379、0.794、0.827， Bias值 分 別 為 -0.047、 -0.117、 -0.038、0.049、 -0.024、 -0.046、 0.029、 0.016、 0.081、-0.105、0.213；外部驗(yàn)證 RSQ值分別為 0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，Bias值分別為-0.093、-0.035、2.275、 -0.398、 -0.008、 -0.149、 0.030、 0.008、-0.153、-0.222、-0.104(表 5)。

表4 驗(yàn)證集油菜秸稈營養(yǎng)成分含量Table 4 The result of nutrient content of rape straw in validation set

表5 最佳定標(biāo)模型驗(yàn)證結(jié)果Table 5 The result of best calibration model validation

3 討論

20世紀(jì)70年代Norris等[12]使用近紅外光譜技術(shù)測定了苜蓿(Medicago sativa)、高羊茅(Festca arundinacea)等飼草原料中CP、NDF與ADF等的含量，證實(shí)了近紅外光譜技術(shù)用于快速評定飼草質(zhì)量的可行性。迄今，隨著近紅外光譜技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，NIRS已被更加廣泛的應(yīng)用于飼料常規(guī)營養(yǎng)成分、肉品質(zhì)及乳品質(zhì)分析的研究中[13-15]，進(jìn)一步肯定了NIRS對飼料營養(yǎng)價(jià)值評定、畜產(chǎn)品安全評定的可行性，推動(dòng)了畜牧業(yè)的快速發(fā)展。

NIRS技術(shù)的測定結(jié)果會受到樣品因素、參比值的準(zhǔn)確性、儀器的穩(wěn)定性及操作環(huán)境等諸多因素的影響[16-17]，其中樣品因素尤為重要，因此采集樣品需具有代表性；史永剛等[18]研究指出待測樣品的代表性和濕化學(xué)分析結(jié)果會對近紅外分析結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響，本研究采用的采樣方法和營養(yǎng)成分測定方法為國家標(biāo)準(zhǔn)方法或公共認(rèn)可方法，測定過程中進(jìn)行多次重復(fù)，平行測定值之間的誤差均在所要求范圍內(nèi)，其中CP、EE、SP、NPN測定結(jié)果的變異系數(shù)較大，高于50%，其余各指標(biāo)測定結(jié)果變異系數(shù)均較小。

大量學(xué)者利用NIRS分析技術(shù)評定飼料營養(yǎng)價(jià)值且該技術(shù)已是測定飼料營養(yǎng)成分的方法之一。Yang等[19]利用NIRS技術(shù)對我國西南地區(qū)的燕麥(Avena sativa)進(jìn)行了飼料化學(xué)品質(zhì)的測定，測定項(xiàng)目主要包括CP、ADF、NDF與水溶性碳水化合物(WSC)，結(jié)果表明對于CP、NDF、ADF與WSC含量的最佳模型其波長位置為 4 247～6 102 cm-1、4 247～ 5 450 cm-1、 5 446～ 6 102 cm-1和 4 247～4 602 cm-1，且預(yù)測值與測定值具有較高的相關(guān)性(R2CV, CP = 0.99，NDF = 0.94，ADF = 0.92，WSC =0.88)，其指標(biāo)模型可用于日常分析。Asekova[20]以不同品種的大豆(N = 353)為研究對象，對CP、CF、NDF和ADF利用NIRS技術(shù)構(gòu)建模型，研究結(jié)果表明CP、CF最佳定標(biāo)模型所對應(yīng)的光譜處理和參數(shù)為 (2，5，5，1; MSC)，NDF 和 ADF 最佳定標(biāo)模型所對應(yīng)的光譜處理和參數(shù)為(1，4，4，1; MSC)，其構(gòu)建模型可以用于大豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值的預(yù)測；劉賢等[21]以158個(gè)不同種類的青貯秸稈飼料為研究對象，利用近紅外反射光譜技術(shù)建立了常規(guī)營養(yǎng)成分含量的定量校正分析模型，研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)營養(yǎng)成分校正模型的R2≥ 0.86，可以用于快速測定秸稈青貯飼料的營養(yǎng)成分；白琪林等[22]與邰書靜等[23]均以玉米秸稈為試驗(yàn)材料，構(gòu)建玉米秸稈ADF、NDF含量的NIRS分析模型，其NDF和ADF近紅外校正模型校正系數(shù)均大于0.90；以上大量研究均表明，NIRS技術(shù)已廣泛用于飼料原料營養(yǎng)成分分析中，同時(shí)驗(yàn)證了NIRS對飼料營養(yǎng)價(jià)值評定的可行性，本研究油菜秸稈定標(biāo)模型的各營養(yǎng)成分指標(biāo)所對應(yīng)的1-VR值除NDIP、ADIP和ADL指標(biāo)外，其余各指標(biāo)1-VR均在0.9左右；內(nèi)部驗(yàn)證RSQ 值 分 別 為 DM 0.901，CP 0.938， NDF 0.586，ADF 0.710， EE 0.922， Ash 0.788， NDIP 0.392，ADIP 0.580，ADL 0.379，NPN 0.794，SP 0.827；外部驗(yàn)證RSQ值分別為0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，通過以上結(jié)果可以看出，內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果優(yōu)于外部驗(yàn)證結(jié)果，這可能與飼料樣品的性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室測定值的誤差以及所選取的外部驗(yàn)證樣本數(shù)有關(guān)，在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)注意樣本數(shù)對外部驗(yàn)證結(jié)果的影響[24]。在本研究中，油菜秸稈DM、CP、ADF、EE、Ash、NPN和SP等營養(yǎng)成分的校正模型是可用的，其余營養(yǎng)成分利用NIRS技術(shù)進(jìn)行檢測的可行性需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究利用近紅外光譜分析技術(shù)對油菜秸稈樣品的營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，建立了近紅外定標(biāo)模型，同時(shí)篩選出各營養(yǎng)成分最優(yōu)組合，DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash和 SP的 1-VR均在 0.9左右，所構(gòu)建的NIRS模型可用于日常分析。然而，NDIP、ADIP和ADL所構(gòu)建NIRS模型效果不太理想，需進(jìn)一步優(yōu)化模型。NIRS可以作為可靠、快速的分析工具，取代耗時(shí)耗力的濕化學(xué)分析方法，是一種廉價(jià)、綠色安全的分析技術(shù)，在動(dòng)物營養(yǎng)方面，能夠及時(shí)掌握、調(diào)整飼糧配方進(jìn)而使得動(dòng)物生產(chǎn)性能最大化。