李京蓉，馬 真，劉澤華，喬安海，鄧艷芳，王文穎，姚步青,，楊正榮，張春輝，周華坤,

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所 / 青海省寒區(qū)恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點實驗室，青海 西寧 810001；2. 青海師范大學(xué)，青海 西寧 810008；3. 青海省草原總站，青海 西寧 810001；4. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧810016；5. 青海省鐵卜加草原改良試驗站，青海 鐵卜加 813000）

在全球范圍內(nèi)，鹽是限制植被產(chǎn)量和品質(zhì)的最重要的環(huán)境因素之一[1-2]。鹽堿化是當(dāng)今世界荒漠化和耕地退化的主要原因之一，這也引起了科研人員對植物鹽堿抗性生理和生態(tài)的關(guān)注和研究[3]。在干旱半干旱地區(qū)，降水量少、蒸發(fā)量大、用水量不合理等因素是造成鹽脅迫的重要原因[4]。鹽脅迫環(huán)境通過影響作物生長發(fā)育而影響作物的產(chǎn)量[5]。青海省地處中國西北地區(qū)，干旱、半干旱、大面積的鹽堿地是制約當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素[6]。如何合理有效地利用和改善鹽堿地，對促進青海地區(qū)的農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展具有積極意義。

青海省高寒草甸的禾本科牧草具有良好的適應(yīng)性和耐鹽性[7]，可以用于改善鹽堿地。禾本科牧草的耐鹽性通常優(yōu)于豆科牧草和普通作物[8]。在鹽脅迫條件下植物種子能否正常發(fā)芽及生長是植物生長發(fā)育及能否建植成功的先決條件[9-10]。因此，對鹽脅迫條件下禾本科牧草種子萌發(fā)和幼苗生長的研究具有重要意義。本研究所選6種牧草均屬禾本科多年生牧草，多分布于海拔高度3 000-4 300 m的天然草地，是改善干旱、鹽堿草地和栽培草地建植的優(yōu)良草種，也是退化草地恢復(fù)和水土保持的重要草種[11]。但目前處于試驗階段，并未在生產(chǎn)建設(shè)中大規(guī)模使用。本研究對鹽脅迫條件下6種禾本科牧草萌發(fā)期和苗期的各指標(biāo)變化情況進行分析，通過隸屬函數(shù)綜合評價供試禾本科牧草耐鹽能力的強弱，旨在對牧草耐鹽鑒定、耐鹽性新品種的選育和應(yīng)用及鹽堿地的改良利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取了6種在青海省分布較為廣泛的禾本科牧草進行抗鹽性評價，詳情如表1所列。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗方法

1.2.1 牧草萌發(fā)期試驗

種子處理：選擇成熟、飽滿、中等大小、均勻、無病的健康種子于1% NaCl溶液中浸泡15 min，然后用蒸餾水沖洗3遍并放置在鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量的NaCl溶液(濃度分別為 70、140 和 280 mmol·L-1)，對照 (CK)加入蒸餾水。培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱，溫度控制在20 ℃，每天光照12 h，每天加入相同體積的NaCl溶液，對照加蒸餾水，每4 d更換濾紙以使水勢的變化最小化。每個處理(包括CK)設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)選用50粒種子。自種子置于培養(yǎng)箱中開始觀察，以胚芽長度等于發(fā)芽種子1/2的長度為標(biāo)準(zhǔn)。將重復(fù)中最早有1粒發(fā)芽的日期作為開始，此后每天記錄發(fā)芽種子的數(shù)量，當(dāng)連續(xù)15 d不再有種子發(fā)芽時作為發(fā)芽結(jié)束期[12-14]，并按下式計算。

發(fā)芽率 = (正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)) × 100%。

1.2.2 牧草苗期試驗方法

選擇土壤進行篩分，除去石頭及雜質(zhì)，將沙∶有機肥∶土按1∶1∶4的混合基質(zhì)置于塑料花盆中，用清水澆透，在花盆中均勻撒下消毒后的種子，用干土輕輕覆蓋，播種深度為1 cm。播種后，幼苗長至2～3片葉時進行間苗，每盆留30株。6種牧草每種5盆，共30盆。待生長到4～5片葉時進行NaCl處理。NaCl處理濃度分別為 50 、100 、150、200 mmol·L-1，對照用蒸餾水，每個處理4次重復(fù)。在NaCl處理前3 d對所有牧草進行澆水處理，使每盆土壤處于飽和含水狀態(tài)(土壤含水量保持在 22.8% ± 2.0%)。NaCl處理采用濃度梯度遞升的方式依次進行處理，14 d后分別對各生理指標(biāo)進行測定。

1.3 牧草苗期生理指標(biāo)測定及方法

1.3.1 丙二醛 (MDA)含量

將試驗材料磨成漿液于離心管中，離心10 min，上清液為萃取物，取上清液測其體積。在提取液中加入 2 mL 0.3% TBA 溶液，沸水浴中 15 min 后立即冷卻，再次離心15 min，取上清液，測定450、532、600 nm 波長的吸光度。根據(jù) CMDA= 6.45(D532－D600) － 0.56D450，計算出MDA的濃度，再按下式得出MDA的含量[15-16]。

MDA 含量 = (MDA 濃度 × 提取液體積)/植物組織鮮重。

1.3.2 葉綠素相對含量

稱取剪碎的鮮樣0.3 g，于研缽中研磨成勻漿，加80%丙酮，繼續(xù)磨至組織變白，再過濾至25 mL容量瓶中，反復(fù)用丙酮清洗數(shù)次，最后用丙酮定容至25 mL。以80%丙酮為空白對照，測定470、646、663 nm波長下的吸光值。

Ca＝ 12.21D663－ 2.81D646；

Cb= 20.13D646－ 5.03D663；

葉綠素總濃度 C ＝ Ca＋ Cb；

Cx.c= (1 000D470－ 3.27Da－ 104Cb) / 229；

式中：Ca、Cb分別表示葉綠素a和葉綠素b的濃度；Cx.c表示類胡蘿卜素的總濃度。

根據(jù)下式計算組織中各色素的含量：

色素含量 = (色素濃度 C × 提取液總量 × 稀釋倍數(shù) × 1 000) / 樣品葉片鮮重。

1.3.3 可溶性糖含量

將樣品置于試管中并封口，在沸水中提取30 min，冷卻后吸取0.5 mL提取液于加有1.5 mL蒸餾水的試管中，并依次加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸充分振蕩，逐管立即準(zhǔn)確保溫1 min，蒸餾水作對照，測定其在630 nm波長下的吸光度值。

可溶性糖含量 = (C × V/a) / W；

式中：C為葡萄糖量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得(μg)；V是提取液總體積(mL)；a為測定時所吸取的體積(mL)；W為樣品重(g)。

1.3.4 游離脯氨酸含量

用3%的磺基水楊酸在沸水浴中提取15 min后，用酸性茚三酮法顯色，然后用甲醛萃取，避光靜置4 h后，吸取甲苯層在520 nm波長下測定吸光度[1]。

脯氨酸 = (C × V/a) / W；

式中：C為四氮唑還原量(mg)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；V為提取液總體積(mL)；a為測定時所吸取的體積(mL)；W為樣品重(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗所得數(shù)據(jù)通過 Microsoft Excel 2007 進行處理并作圖；用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對相同物種不同濃度間，以及相同濃度不同物種間的各項生理指標(biāo)；用Student-Newman-Keuls方法進行在0.05顯著水平上的多重比較；用Origin制圖軟件制作插圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對6種禾本科牧草萌發(fā)期影響

草原看麥娘種子( Alopecurus pratensis)的萌發(fā)率在每個濃度梯度均顯著高于其余5種牧草(P ＜0.05)(圖 1)，除 NaCl濃度 280 mmol·L-1，扁穗冰草(Agropyron cristatum) 萌發(fā)率和其余 5 種牧草均存在顯著差異。而不同濃度NaCl同一物種間除扁穗冰草在 NaCl濃度 140和 280 mmol·L-1差異不顯著外，其余均存在顯著差異(P＜0.05)，且隨濃度的增大萌發(fā)率顯著下降。

2.2 NaCl處理對6種禾本科牧草苗期各生理指標(biāo)影響

2.2.1 6種禾本科牧草丙二醛含量的變化

圖1 不同NaCl濃度處理下6種牧草的萌發(fā)率Figure 1 Germination rate of 6 pastures under different NaCl concentrations

表2 不同NaCl濃度處理下6種牧草丙二醛含量Table 2 MDA content of six grass species under NaCl treatment μmol·g-1

隨著NaCl脅迫強度的增加，各牧草葉片中的MDA含量均顯著升高 (P＜0.05)(表 2)。NaCl濃度在 0～100 mmol·L-1時牧草葉片中 MDA 含量變化幅度較小，說明牧草幼苗對低濃度NaCl脅迫有一定耐受能力；隨著NaCl脅迫的加劇，在150和200 mmol·L-1的NaCl濃度下，扁穗冰草和同德貧花鵝觀草(Roe gneria pauciflora Tongde)的 MDA含量增加較多，分別是對照的9.14、12.31倍和7.84、11.81倍；增加較少的是草原看麥娘和無芒雀麥，分別是對照的5.72、8.54倍和5.84、8.14倍。這表明扁穗冰草、同德貧花鵝觀草受到的傷害較大，草原看麥娘、無芒雀麥?zhǔn)艿降膫t較小。

2.2.2 6種禾本科牧草葉綠素含量的變化

隨著NaCl濃度的增大，6種禾本科牧草的葉綠素含量呈現(xiàn)先升后降的變化，同一物種在不同NaCl濃度下的葉綠素含量差異顯著 (P＜0.05)(表 3)。NaCl濃度為 50 mmol·L-1時，所有牧草的葉綠素含量均最高；NaCl濃度為 200 mmol·L-1時，所有牧草葉綠素含量較對照均顯著下降(P＜0.05)，同德貧花鵝觀草下降的最多，較對照下降了84.5%，葉綠素含量最少，受NaCl脅迫傷害大；而草原看麥娘下降最少，較對照下降了49.4%，受NaCl脅迫傷害?。煌露堂⑴麎A草和大穎草分別下降了60.7%和59.5%，耐鹽性居中間。

2.2.3 6種禾本科牧草可溶性糖含量的變化

6種禾本科牧草的可溶性糖含量呈先增加后降低的趨勢 (表 4)，NaCl濃度為 100 mmol·L-1時，所有牧草的可溶性糖含量均最高，150～200 mmol·L-1時可溶性糖含量下降，200 mmol·L-1時的可溶性糖含量最低。同一濃度下6種禾本科牧草間可溶性糖均值比較，無芒雀麥可溶性糖含量最高，顯著高于其他所有牧草(P＜0.05)；其次是草原看麥娘；同德貧花鵝觀草和扁穗冰草之間、同德短芒披堿草和大穎草之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但后兩種顯著高于前兩種牧草。

表3 NaCl處理下6種牧草葉綠素含量的變化Table 3 Changes of chlorophyll content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表4 NaCl處理下 6 種牧草可溶性糖含量的變化Table 4 Changes of soluble sugar content of six grass species under NaCl treatment mmol·g-1

2.2.4 6種禾本科牧草脯氨酸含量的變化

隨著NaCl濃度的增加，6種禾本科牧草葉片中的脯氨酸含量也顯著增加(P＜0.05)(表5)。同一濃度不同物種間的脯氨酸均值，大穎草、扁穗冰草和同德短芒披堿草之間、草原看麥娘和無芒雀麥之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，但后兩種顯著高于前3種。

2.2.5 6種禾本科牧草耐鹽性綜合評價

將參試的6種禾本科牧草與抗鹽性有關(guān)指標(biāo)進行綜合分析，計算不同材料各指標(biāo)隸屬度值，并以各材料的平均抗鹽隸屬度作為耐鹽鑒定綜合評價指標(biāo)。結(jié)果顯示，6種牧草的耐鹽性強弱表現(xiàn)為，無芒雀麥＞草原看麥娘＞大穎草＞同德短芒披堿草＞扁穗冰草＞同德貧花鵝觀草(表6)。

3 討論

影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長的重要因素是鹽[3]。羅志娜等[17]通過對燕麥(Avena sativa)種子的耐鹽性的研究，得出隨鹽脅迫的加劇，低鹽對種子萌發(fā)的影響極小，高鹽則對種子萌發(fā)的抑制作用很強[18]。也有研究[19]指出，鹽脅迫的濃度達到一定值時，增加的鹽濃度對植物的種子萌發(fā)和幼苗生長形成抑制效應(yīng)。史燕山等[20]的研究表明，在低鹽下某些植物種子的萌發(fā)率顯著高于對照，而高鹽脅迫下，種子的萌發(fā)率顯著降低。本研究中只有扁穗冰草在 70 mmol·L-1濃度的 NaCl處理下種子的萌發(fā)率有一點升高，其他牧草相比對照呈下降趨勢，因此，高鹽脅迫對種子萌發(fā)有明顯的抑制作用，其抑制程度不同是由于不同物種對鹽的耐性不同所致。

表5 NaCl處理下 6 種牧草脯氨酸含量的變化Table 5 Changes of proline content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表6 各牧草對NaCl處理適應(yīng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及評價Table 6 Membership value and evaluation of adaptation indexes of herbage to NaCl treatment

MDA和脯氨酸是抗鹽脅迫的重要抗氧化劑。受鹽脅迫的牧草通過增加滲透調(diào)節(jié)物的含量，來維持正常的生理代謝，從而增加對鹽的抗性[21-22]。在本研究中，當(dāng)NaCl濃度較低時，牧草能抵抗脅迫，但不同的牧草對鹽脅迫的敏感度不一樣，NaCl濃度的增加會破壞或傷害牧草的膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致膜通透性增大，滲透調(diào)節(jié)物外滲，脂質(zhì)化增強，影響幼苗生長。因此，牧草中MDA和脯氨酸的增加是牧草對鹽的耐受性增強的表現(xiàn)。本研究結(jié)果表明，扁穗冰草、同德貧花鵝觀草受鹽脅迫的傷害最大，草原看麥娘、無芒雀麥?zhǔn)茺}脅迫的傷害則最小，大穎草、同德短芒披堿草受鹽脅迫的傷害居中。

葉綠素不僅能吸收和傳遞光能，還是光合作用必不可少的原料，是植物光合能力的重要指標(biāo)。在鹽堿脅迫下，葉片細胞的葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠素含量在一定程度上降低并影響光合作用。大多數(shù)對于不同NaCl濃度對葉綠素含量的影響的研究發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫顯著降低牧草中的葉綠素含量[23-25]。在本研究中，隨著NaCl濃度的增加，6種牧草的葉綠素含量先增加后降低，同一物種的葉綠素含量有顯著差異(P＜0.05)，呈現(xiàn)出低NaCl濃度處理促進葉綠素的合成，高NaCl濃度則抑制其合成，這與之前的研究一致[26]。這是因為鹽脅迫下高濃度的鹽分破壞細胞內(nèi)的色素-蛋白-脂質(zhì)復(fù)合體，降低葉綠素a和其他色素的含量，所以隨NaCl濃度的增加，呈現(xiàn)先增后減的趨勢。

可溶性糖是植物細胞的主要有機滲透調(diào)節(jié)因子，它直接反映了細胞遭受傷害的程度，其總含量也決定了植物對鹽脅迫的抗性[26]。本研究表明可溶性糖含量在 NaCl濃度為 100 mmol·L-1時最高，在 150～200 mmol·L-1下降，表明低鹽濃度促進牧草滲透調(diào)節(jié)力，而高鹽濃度已經(jīng)使牧草受到鹽害。NaCl濃度為100 mmol·L-1也可作為本研究材料鹽脅迫的臨界值，可以為實踐應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究在室內(nèi)對6種禾本科牧草做了鹽脅迫試驗，但還有待于到實際生態(tài)環(huán)境中去檢驗。在今后的研究中，建議能與實際環(huán)境條件和生產(chǎn)實際有機結(jié)合，則能更完整地說明6種牧草的抗鹽性，以及對不同NaCl濃度梯度的響應(yīng)，從而選出真正需要的抗鹽型高寒牧草。

4 結(jié)論

本研究運用隸屬函數(shù)對6種禾本科牧草種子萌發(fā)及幼苗的耐鹽性進行綜合評價分析，得出各供試材料的耐鹽性強弱表現(xiàn)為無芒雀麥＞草原看麥娘＞ 大穎草＞同德短芒披堿草＞扁穗冰草＞同德貧花鵝觀草。