李冉浩，魏楓，王瑋

內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內分泌科，內蒙古 包頭0140100

目前腫瘤仍是威脅人類健康和生命的一大難題，近年來惡性腫瘤的發(fā)病率不斷上升，據(jù)統(tǒng)計，2012年發(fā)展中國家惡性腫瘤患病人數(shù)占全球的57%，死亡人數(shù)高達全球的65%[1]。近年來，中國惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率均逐年上升，其治療仍以手術切除為主，放療和化療為輔。盡管近年來醫(yī)療診治水平日益提高，腫瘤的檢出率不斷提高，腫瘤患者的生存情況得以改善，但80%的腫瘤患者就診時已屬于晚期[2]。因此，了解腫瘤的發(fā)生機制，尋找有效的治療方法是目前臨床面臨的重要問題?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，腫瘤的發(fā)生是一個多階段、多因素和多個異?；蚓C合作用的過程，其生物學本質是細胞內遺傳調控和表觀遺傳調控的紊亂與失調。DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳調控的主要方式，其中以DNA甲基化最為常見，即基因的表型受到抑制，表達發(fā)生改變，但并不涉及DNA核苷酸序列的變化，而只是部分堿基發(fā)生甲基化的修飾。DNA甲基化是一個可以被逆轉的過程，通過去甲基化藥物可以恢復基因的功能，抑制腫瘤的生長，因此成為腫瘤治療的新靶點[3]。目前臨床上認為5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR）的去甲基化作用較為肯定。本文對5-Aza-CdR在細胞系、動物實驗和臨床試驗中的抗腫瘤研究進展作一綜述。

1 5-Aza-CdR的生物學活性及作用機制

5-Aza-CdR是DNA甲基化轉移酶抑制劑，于1964年被Pliml和Storm首次合成，其中文名稱為地西他濱。2006年5-Aza-CdR作為去甲基化藥物被美國食品藥品管理局（FDA）批準治療骨髓增生異常綜合征、慢性髓系白血病等惡性腫瘤[4]。5-Aza-CdR為白色或類白色晶體狀粉末，無味，分子式為C8H12N4O4，分子量為228.21，可在體內外逆轉因DNA異常甲基化導致的惡性腫瘤，使因高甲基化而沉默的抑癌基因被激活，導致細胞分化和（或）凋亡，阻止腫瘤進一步發(fā)展[5-7]。研究表明，5-Aza-CdR可通過去甲基化作用有效地抑制腫瘤細胞的生長和增殖，降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，阻滯腫瘤細胞的生長周期，促進腫瘤細胞凋亡，最終抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。隨著研究的深入，5-Aza-CdR在動物模型中的應用也獲得了成功，并逐步進入臨床試驗。有關5-Aza-CdR去甲基化對腫瘤的影響已有許多報道，5-Aza-CdR已成功作用于肺腺癌[9]、結腸癌[10]、膀胱癌[11]等。

2 5-Aza-CdR與腫瘤治療

2.1 甲狀腺癌

研究表明，重組人絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制因子A成員5（serpin family A member 5，SERPINA5）的甲基化與BRAF突變有關，而BRAF基因突變會使甲狀腺癌的復發(fā)風險增加[12]。Lee等[13]應用5-Aza-CdR處理甲狀腺癌細胞株（TPC1、WRO82-1和XTC），發(fā)現(xiàn)SERPINA5在3種細胞株中均發(fā)生了去甲基化，說明5-Aza-CdR可以降低甲狀腺癌的復發(fā)率，為預測甲狀腺癌的復發(fā)提供了實驗依據(jù)。甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）的惡性程度較高，且對化療和放療藥物高度耐受。Vitale等[14]研究了5-Aza-CdR與抗腫瘤藥物依維莫司在人MTC細胞MZ-CRC-1（對依維莫司單獨最耐受的細胞系）中的作用。實驗分為4組：A組兩種藥物等劑量（IC50）、B組依維莫司劑量相對較高[依維莫司（IC50）/5-Aza-CdR（IC25）]、C組 5-Aza-CdR劑量相對較高[依維莫司（IC25）/5-Aza-CdR（IC75）]和空白對照組，應用CALCUSYN軟件評估藥物之間的相互作用，C組中觀察到協(xié)同作用，而B組中觀察到拮抗作用；采用噻唑藍測定細胞活力，與對照組相比，B組和C組治療6天后觀察到細胞凋亡數(shù)均加倍。提示5-Aza-CdR可以逆轉化療藥物的耐藥性，從而抑制腫瘤細胞的生長，說明5-Aza-CdR在抗腫瘤中不僅單藥有效，在聯(lián)合用藥方面也有顯著的效果。

2.2 血液病

2.2.1 淋巴瘤Guo等[15]采用5-Aza-CdR對人伯基特淋巴瘤細胞裸鼠進行研究，造模成功后，隨機分為實驗組（9只）和對照組（9只），采用腹腔注射的給藥方式，實驗組采用5-Aza-CdR處理，對照組予以0.9%氯化鈉溶液，24天后處死裸鼠，實驗組抑瘤率為27.98%。將組織切片行逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）、甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific-polymerase chain reaction，MS-PCR）發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組抑癌基因CHFR mRNA的相對表達量明顯升高，甲基化條帶明顯變暗，同時出現(xiàn)非甲基化條帶。提示5-Aza-CdR不僅能夠抑制淋巴瘤裸鼠移植瘤的生長，還能夠去除抑癌基因CHFR的甲基化狀態(tài)，使CHFR的功能得以恢復，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Wang等[16]采用濃度為1、4、7、10 μmol/L的5-Aza-CdR處理淋巴瘤Raji細胞作為實驗組，對照組予以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，隨著5-Aza-CdR濃度的升高，細胞凋亡率增加。采用MS-PCR法檢測基因表達情況，出現(xiàn)了與動物實驗相似的結果，即甲基化條帶變暗，同時出現(xiàn)了非甲基化條帶，提示5-Aza-CdR可以促進腫瘤細胞凋亡，并可能通過抑制CHFR的甲基化而加速細胞凋亡。Stathis等[17]對非霍奇金淋巴瘤患者應用5-Aza-CdR聯(lián)合抗腫瘤藥物伏立諾他進行了Ⅰ期臨床試驗，該研究納入43例患者，其中14例患者采用最大耐受劑量（maximal tolerable dose，MTD）即先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）處理，第6～12天改為伏立諾他200 mg/d，另12例患者先用5-Aza-CdR 10 mg（/m2·d）處理，第3～9天改為伏立諾他200 mg/d，其他患者一直采用聯(lián)合用藥。聯(lián)合組中11例患者治療4個周期后病情穩(wěn)定，3例患者可持續(xù)生存8個或更多周期；單藥組中4例患者發(fā)生血小板減少癥，2例患者發(fā)生中性粒細胞減少癥。由于患者例數(shù)較少，兩種藥物的最佳單藥劑量仍然未知，但值得肯定的是所有患者均得到了不同程度的獲益。

2.2.2 骨髓瘤Atallah等[18]開展了一項有關5-Aza-CdR治療多發(fā)性骨髓瘤的Ⅲ期臨床試驗，共納入170例患者，試驗組89例，對照組81例。試驗組患者接受5-Aza-CdR聯(lián)合標準治療方案，對照組患者接受單純的標準治療方案，結果發(fā)現(xiàn)，試驗組患者的緩解率為17%，對照組患者的緩解率為0，前者的平均完全緩解時間為10.3個月，表明5-Aza-CdR可延長多發(fā)性骨髓瘤患者的生存時間。

2.3 肺癌

Liu等[9]將人肺腺癌細胞系A549、H838接種于裸鼠體內，分為A組（0.9%氯化鈉溶液處理）、B組（500 nmol/L 5-Aza-CdR處理）、C組[500 nmol/L恩替司他（MS-275）處理]、D組（5-Aza-CdR+MS-275處理）。結果顯示，與A組相比，B組和D組的DNA甲基化轉移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表達水平降低，Ras相關結構域蛋白1A（Rasassociation domain family protein 1A，RASSF1A）表達水平顯著增加、甲基化水平下降，腫瘤體積縮小，提示無論是否有MS-275處理，5-Aza-CdR都可抑制腫瘤生長。Momparler[19]對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者進行了Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗，對未進行過化療的5例Ⅳ期NSCLC患者靜脈輸注5-Aza-CdR，劑量為200～660 mg/m2，5例患者的生存時間分別為 4.3、6.7、9.3、15.3和16.0個月，唯一的不良反應是粒細胞減少。該研究結果表明，大劑量輸注5-Aza-CdR并未延長患者的生存時間，可能與樣本量較小有關。

2.4 消化道腫瘤

2.4.1 胃癌 卞庚等[20]在裸鼠右側肋部皮下注射0.1 ml胃癌細胞MKN-45懸液，造模成功后隨機分為對照組（0.9%氯化鈉溶液處理）、5-Aza-CdR組（2 mg/kg 5-Aza-CdR處理）、化療藥物組（1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶處理）、聯(lián)合組（2 mg/kg 5-Aza-CdR+1 mg/kg紫杉醇+5 mg/kg氟尿嘧啶處理）。3周后處死裸鼠，結果顯示，與對照組相比，5-Aza-CdR組和化療藥物組的移植瘤生長速度明顯減慢，而聯(lián)合組的移植瘤生長速度下降最為明顯，化療藥物組腫瘤轉移相關蛋白波形蛋白（vimentin）的表達水平無明顯變化，5-Aza-CdR組vimentin的表達明顯下降，聯(lián)合組vimentin的表達下降更顯著。提示5-Aza-CdR可以通過抑制vimentin的表達，抑制MKN-45移植瘤的生長和轉移。說明5-Aza-CdR不僅對原發(fā)腫瘤具有抑制作用，還具有抵抗腫瘤轉移的能力。

2.4.2 肝癌Yuan等[21]以5-Aza-CdR處理的肝癌細胞HepG2作為實驗對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測基因的表達量，結果顯示，5-Aza-CdR明顯激活了抑癌基因PTEN和先天免疫相關基因STAT1的表達，而致癌基因CD44和HSPA4的表達則受到了明顯抑制。

2.4.3 胰腺癌Pan等[22]采用抗腫瘤藥物大黃素（40 μmol/L）、5-Aza-CdR（1 μmol/L）、大黃素+5-Aza-CdR處理胰腺癌PANC-1細胞株72 h，分別作為A組、B組和C組，對照組采用0.1%二甲基亞砜處理。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，A組和B組的DNMT1和DNA甲基化轉移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）表達水平均降低，抑癌基因p16和RASSF1A的甲基化水平呈不同程度下降，蛋白表達均顯著增加；而B組較A組更明顯，C組上述指標的改變較A組和B組更為顯著。提示大黃素聯(lián)合5-Aza-CdR可通過降低DNMT1和DNMT3A的表達，增強p16、RASSF1A的去甲基化作用，從而發(fā)揮抗腫瘤效應。

2.5 泌尿系統(tǒng)腫瘤

2.5.1 前列腺癌McCabe等[23]采用5-Aza-CdR治療TRAMP前列腺癌小鼠，實驗組采用5-Aza-CdR處理，對照組予以等量的0.9%氯化鈉溶液，結果顯示，實驗組的14只小鼠在24周齡時被治愈，而對照組13只小鼠中有7只發(fā)展為低分化前列腺癌，與對照組相比，5-Aza-CdR處理可以延長小鼠的生存時間。Chiam等[24]應用0～20 mmol/L 5-Aza-CdR每日和隔日處理人前列腺癌細胞LNCaP，與對照組（無藥物處理）相比，每日處理組在所有濃度下均能有效抑制LNCaP細胞增殖，隔日處理組較低劑量5-Aza-CdR的作用強，每日處理組達到上述抑制作用需要的5-Aza-CdR劑量較低。

2.5.2 膀胱癌Bender等[25]應用5-Aza-CdR處理膀胱癌T24細胞接種的裸鼠，發(fā)現(xiàn)裸鼠的移植瘤較未處理組明顯縮小，表明5-Aza-CdR可減緩腫瘤的生長。單用絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）后耐藥性的發(fā)生是膀胱癌治療中的難題，且P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）、多藥耐藥相關蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）的表達增加提示腫瘤患者的預后不良[26]。Zhang等[11]應用不同濃度的5-Aza-CdR和MMC處理膀胱癌T24細胞，結果顯示，隨著5-Aza-CdR濃度的增加，T24細胞增殖率降低，Pgp、MRP1的表達水平降低。

2.6 婦科腫瘤

2.6.1 卵巢癌 卵巢癌化療失敗的主要原因是卵巢癌細胞對順鉑的敏感性降低[27]。低劑量的5-Aza-CdR雖無直接的抗腫瘤作用，但能通過改變卵巢癌耐藥細胞中hMLH1基因的甲基化狀態(tài)，從而逆轉腫瘤對順鉑的耐藥，因此低劑量的5-Aza-CdR聯(lián)合化療藥物可能達到更好的臨床治療效果。2.6.2乳腺癌Kang等[28]應用不同濃度的5-Aza-CdR對乳腺癌細胞MCF-7進行體外培養(yǎng)，結果顯示，runt相關轉錄因子3（runt related transcription factor 3，RUNX3）在MCF-7細胞中表達下調且高度甲基化，經(jīng)5-Aza-CdR處理，RUNX3的mRNA及蛋白表達水平均升高，且較處理前的細胞，其增殖受到抑制且凋亡率增加，表明5-Aza-CdR可以通過降低RUNX3的高甲基化狀態(tài)并恢復其表達，抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。在卵巢癌[29]、宮頸癌[30]細胞株中也有相似的研究結果。

3 小結

5-Aza-CdR可以通過去甲基化作用阻滯腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞和實體瘤生長，還可以有效抑制腫瘤轉移，因其與化療藥物具有協(xié)同作用，故聯(lián)合應用可提高化療藥物的敏感性，延緩腫瘤進展。無論是在細胞水平還是動物實驗研究，5-Aza-CdR的抗腫瘤作用均得到了廣泛的認可，在其抗腫瘤機制不斷被發(fā)現(xiàn)的同時，5-Aza-CdR作為抗腫瘤藥物也已應用于臨床。雖然在大部分臨床試驗中5-Aza-CdR顯示出了抗腫瘤作用，但仍有臨床試驗發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR在發(fā)揮去甲基化作用的同時反而促進了腫瘤的發(fā)展[31]。5-Aza-CdR的應用還出現(xiàn)了許多藥物相關的不良事件，如骨髓壓迫、惡心和嘔吐等，尤其在用藥劑量方面，仍然存在諸多未解決的問題。由于5-Aza-CdR在各類腫瘤患者中的抗腫瘤效應及不良反應不同，其臨床應用存在一定的局限性，仍需大量深入的研究進一步證實。