鄒洋洋,楊旻

臨床上我們經常會遇到許多缺血性損傷疾病，如各種休克、器官移植、血栓形成或栓塞、心肺復蘇等。在以前，傳統(tǒng)的觀點認為缺血性損傷疾病主要是供氧不足和能量傳遞障礙導致的細胞損傷為主，因此在治療上提出因盡早恢復缺血組織的血液灌注。然而，在臨床上我們發(fā)現即使恢復缺血組織灌注也不會減輕損傷的進展，相反，在部分個體或器官上會出現加重情況甚至出現遠隔器官的功能障礙。1985年有學者就上述現象提出了缺血再灌注損傷概念，將缺血或缺氧的組織器官損傷后恢復循環(huán)灌注后導致缺血性損傷情況加重的現象稱為缺血再灌注損傷。從缺血再灌注的提出到現在仍未完全清楚其產生的病理生理機制，它是一個由多種細胞和介質共同參與的復雜病理生理過程。就目前研究缺血再灌注損傷產生的機制途徑來說其核心環(huán)節(jié)主要包括氧自由基的大量產生，微血管功能障礙，細胞內鈣超載，過度炎癥反應的激活，近年最新發(fā)現細胞凋亡可能在再灌注損傷中起重要作用，上述的相關損傷機制不是獨立，它們之間可互相作用、互相激活、互相調節(jié)，其產生都依賴著一個上游載物“內皮細胞”[1]。自從內皮細胞被發(fā)現就有很多研究說明其與許多疾病有著密切的關聯，有研究在缺血再灌注損傷方面內皮細胞的損傷同樣重要。由于缺血再灌注損傷可涉及不同器官和組織甚至遠隔的器官損傷，使得疾病進展的速度和程度難以判斷，且缺少相應的指標來指導治療和評估治療效果?；诖耍谂R床上提出對內皮細胞損傷相關標志物的研究，可以定量或定性地反映內皮細胞損傷的程度，從而判斷疾病的進展和預后，近一步為探討相關治療手段提供理論基礎。

1 缺血再灌注與內皮細胞損傷

內皮細胞不僅存在于血管內壁上，且覆蓋于心臟和淋巴管腔面上呈單層縱向分布。它的功能不只是起到屏障作用還對機體的各方面產生效應。如調節(jié)新生血管的形成參與發(fā)育、女性生理周期和創(chuàng)傷修復等生理反應；影響凝血纖溶過程，內皮細胞可合成和分泌相關凝血因子和纖溶物質在凝血與纖溶之間保持動態(tài)平衡，從而維持正常的血液流動循環(huán)；調節(jié)血管舒張和收縮，內皮細胞分泌的活性物質在調節(jié)血管特別是微循環(huán)血管的張力中發(fā)揮重要作用[2]。

1.1缺血再灌注致內皮損傷途徑有研究表明缺血再灌注早期氧自由基的產生依賴于富含黃嘌呤脫氫酶的毛細血管內皮細胞損傷的釋放，在缺血期由于組織及細胞缺血缺氧時ATP供給不足，一方面ATP分解產生大量的次黃嘌呤堆積在組織和細胞中，另一方面，使依賴ATP的Na+-Ca2+泵失活，Ca2+向細胞內流動增加激活Ca2+依賴的蛋白酶使黃嘌呤脫氫酶轉變?yōu)辄S嘌呤氧化酶。再灌注時大量血液中的氧進入缺血區(qū)域和內皮細胞中，被內皮細胞中堆積的黃嘌呤氧化酶催化生成氧自由基和羥自由基,當內皮細胞中氧自由基超過機體抗氧化能力時就會被釋放到血液中導致全身的細胞膜結構損傷和功能障礙，最終造成惡性循環(huán)[3]。缺血過程中還伴有內源性抗氧化系統(tǒng)降低，如超氧化物歧化酶失活使機體抗氧化能力降低。有研究證明，在家豬心肺復蘇后給予亞低溫保護可以抑制氧自由基的產生，從而可以使內皮細胞分泌的一氧化氮(Nitric Oxide,NO)不至于過度氧化，減輕微血管的過度收縮[4]。

內皮細胞損傷后會導致機體產生級聯反應，對組織和器官的損傷遠遠大于內皮細胞損傷本身帶來的后果。越來越多的研究證明血管內皮細胞和白細胞的相互作用是缺血再灌注損傷重要機制，內皮細胞啟動的損傷被繼之而來的中性粒細胞浸潤、激活[5]。內皮細胞與白細胞的作用主要依靠黏附分子來進行，不同階段由不同的黏附分子按一定的排列介導。首先由選擇素家族的黏附分子所介導的滾動階段，最重要的包括E-選擇素，L-選擇素，P-選擇素。在缺血階段內皮細胞膜表面的P-選擇素、L-選擇素表達上調，數分鐘后就會出現中性粒細胞的趨化滾動，在E-選擇素的影響下中性粒細胞向損傷的內皮細胞旁滾動持續(xù)數小時，然后中性粒細胞上的β2-整合素與內皮細胞上的黏附分子互相結合，使中性粒細胞牢固黏附在內皮細胞上對其產生損傷：①牢固黏附的中性粒細胞使內皮細胞處于一個密閉的環(huán)境將其與血清隔開，血清中的一些抗蛋白酶和自由基清除劑就不能進入內皮細胞中和其中的有害物質從而使內皮細胞損傷；②此時募集的白細胞都為激活的白細胞，其中活化的單核/巨噬細胞可產生炎癥因子如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),從而使內皮細胞損傷，相關機制不明。在對內皮細胞損傷機制的研究中表明給小鼠注射TNF-α后6 h，小鼠的小腸、肺、腎臟等組織均發(fā)生內皮細胞的壞死。另外在一組對膿毒癥中血管內皮細胞損傷的研究中給予膿毒癥大鼠重組人可溶性TNF受體1(rsTNFR1)后，血管內皮損傷明顯減輕從而推斷TNF-α可介導內皮細胞損傷[6]。

內皮細胞內鈣含量的異常升高可在組織缺血后數分鐘內體現出，且再灌注后短期內也可使大量鈣進入細胞內并持續(xù)較長時間?，F研究，鈣超載對再灌注期內皮細胞損傷有著重要的作用。細胞缺血期間，能量代謝障礙導致ATP的缺乏，膜上的Na+泵失活使Na+內流增加，激活Na+-Ca2+交換蛋白通過繼發(fā)性反向轉運將Ca2+轉運至細胞內。同時再灌注期，組織供氧和營養(yǎng)增加激活Na+-Ca2+泵可使缺血期導致的細胞內過高的Na+重新運至細胞外，從而使Ca2+內流增加。Bondarenko等[7]在臨床實驗中發(fā)現，給予N-花生四烯甘氨酸一種血管舒張性能脂氨基酸，可通過抑制Na+-Ca2+交換蛋白觀察到胞內Ca2+超載減輕，再灌注內皮細胞損傷改善。再者，缺血再灌注時內源性兒茶酚胺釋放激活磷脂酶C由此產生三磷酸肌醇(Inositol1,4,5-triphosphate,IP3)和二酰甘油(Diacylglycerol,DG)，IP3可促進細胞內肌質網的Ca2+釋放，DG可通過激活蛋白激酶C調節(jié)上游的Na+-Ca2+泵，同樣使胞內Ca2+濃度升高。鈣超載可引起細胞內線粒體的損傷，但具體的機制仍不清楚。有研究認為可能胞內Ca2+超載，引起線粒體膜通透性轉運孔不可逆過度開放。這樣H+就可自如進入線粒體基質，使氧化呼吸鏈解偶聯ATP合成停止，線粒體基質外流還原性谷胱甘肽耗竭，超氧陰離子大量產生，最終使基質滲透壓增加線粒體損傷[8]。中國學者研究報道在鼠心肌缺血后，細胞內鈣超載可導致線粒體呼吸鏈損傷，最終導致缺血區(qū)內皮細胞損傷[9]。由上所述缺血再灌注時可以通過鈣超載-線粒體-氧化應激使內皮細胞功能障礙。

1.2內皮細胞損傷對機體影響上述已經提出內皮細胞和白細胞的密切關系。缺血再灌注損傷所造成的器官組織功能障礙其中最重要的機制為微血管損傷，其產生為血管內皮細胞和白細胞的相互激活所致。內皮細胞是構成微循環(huán)的重要組織學基礎，缺血時內皮細胞本身釋放的以內皮素為代表的縮血管因子，可致微血管收縮血流速度減緩形成微循環(huán)障礙。另外損傷的內皮細胞產生過量的超氧陰離子和再灌注后活化的白細胞產生的超氧化物可使內源性NO失活，從而使NO介導的微血管舒張功能減退，最終打破微血管舒縮平衡。在正常情況下，血管內皮細胞與血液中的各種物質有相互排斥作用，缺血再灌注時白細胞和內皮細胞牢固黏附然后貼附在富含內皮細胞的微血管表面。一方面，此時的白細胞變形性下降，在狹小毛細血管處出現白細胞的嵌頓造成微循環(huán)障礙。再者，中性粒細胞可以釋放氧自由基、炎性介質等導致微血管堵塞，加重微循環(huán)障礙[10]。此外，白細胞活化可直接損傷微血管內皮的連接，造成其跨細胞通透性及旁細胞通透性增加使缺血組織水腫影響微循環(huán)。上述機制導致微循環(huán)障礙在再灌注后缺血組織會出現“無復流”現象，這就解釋了缺血再灌注后機體組織缺血情況仍得不到緩解的癥狀。

自從20世紀80年代開始，內皮細胞活化在炎癥中作用就廣泛受到關注。內皮細胞易受白細胞和炎癥因子的作用，反之它又可通過誘導蛋白及其它成分的合成、分泌影響炎癥反應的進展。內皮細胞的損傷激活核轉錄因子調控的炎癥相關基因的表達，快速增加細胞因子和化學趨化因子的合成與釋放，這些細胞因子可以通過不同途徑發(fā)揮炎癥效應。一方面，它們能招募白細胞并使其活化，以促進受損組織甚至遠隔器官的炎癥反應，進而導致機體功能障礙。另一方面，它們通過向抗炎細胞拮抗，如分泌抗炎細胞因子的輔助性T細胞2(helper T cell,Th2)。一般炎癥發(fā)生時Th2表達上調，但在缺血再灌注時Th2類細胞能量障礙導致對炎癥因子的刺激不發(fā)生反應性增殖或分泌細胞因子，表現為免疫麻痹。此外這些炎癥因子又可經過內皮細胞旁分泌和自分泌途徑作用與白細胞，釋放更多的炎癥因子形成級聯的“瀑布效應”導致失控性炎癥反應。這就是為什么有很多學者在缺血再灌注相關疾病中發(fā)現類膿毒癥綜合征。Bro-Jeppesen等[11]發(fā)現在心臟停搏病人恢復自主循環(huán)后內皮細胞損傷繼發(fā)血漿中炎癥因子顯著增加，有部分病人引發(fā)炎癥級聯反應形成全身炎癥反應綜合征最終導致多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。

1.3內皮細胞損傷相關藥物治療臨床上已經注意以減少內皮細胞活化、損傷和促進其修復為目標的治療藥物。在些藥物從保護內皮細胞方面改善全身炎癥反應及微循環(huán)障礙等，在很多相關疾病中的治療和轉歸上有重要影響。

烏司他丁是一種廣譜蛋白酶抑制劑可減少炎癥因子的合成，但其具體機體不明。有學者表明烏司他丁可抑制內皮細胞損傷時黏附分子的產生，減緩白細胞與內皮細胞的黏附，使血管微循環(huán)障礙得以改善。在膿毒癥動物實驗中發(fā)現烏司他丁干預組循環(huán)內皮細胞明顯減少且內皮細胞活化特異標志物E-選擇素水平較對照組降低，提示烏司他丁對內皮細胞損傷具有保護作用[12]。血管緊張素-2(Angiogenin,Ang-2)為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的主要活性蛋白，其可刺激過氧化產生及舒血管的內皮NO減少，從而導致內皮功能障礙[13]?？笰ngⅡ藥物經常被用于治療冠狀動脈硬化及高血壓。最新發(fā)現此類藥物都可以激活RAS的另一個成員血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme,ACE2)的產生,其可將AngⅡ催化為Ang-(1-7)。它與Mas受體結合形成ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸，此軸與AngⅡ生物學效應相拮抗可抑制AngⅡ誘導的內皮細胞損傷和氧化應激[14]。Zhang等[15]研究提出使用氯沙坦的藥物組可阻斷AngⅡ誘導的內皮細胞ACE2活性下調作用，抑制動脈粥樣硬化的進展。近年來，他汀類降脂藥物在對血管內皮保護方面研究也比較熱門，其主要機制有人提出是上調NOS表達使iNO釋放增多，且對內皮細胞損傷時內皮素-1的表達具有抑制作用[16]。也有學者認為他汀類藥物可以減少高遷移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)的激活，因為HMGB1作為“損傷模式相關分子”誘導內源性炎癥增加是內皮細胞的通透性遭到破壞。他汀類藥物也可阻斷由HMGB1/TLR4形成的經典內源性炎癥途徑，并且該途徑涉及HMGB1介導的內皮細胞滲透性損傷，由此推測他汀類藥物在缺血再灌注內皮細胞損傷中起重要的保護作用[17]。

2 內皮細胞損傷相關生物標志物

為探索損傷內皮細胞的因素及機制，以及研究受損內皮分泌的活性物質 變化在疾病中的作用及機制，近年來一些具有內皮細胞自身特異性的血清分子標志物被發(fā)現并已經逐漸在臨床上應用，為早期發(fā)現內皮細胞損傷和可及時干預提供了可指導的指標。以下就近年來研究較熱的內皮細胞損傷生物標志物做一概述。

2.1血管性血友病因子內皮細胞特異性分子儲存器為weibel-palade小體，其儲存的主要分子包括血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，內皮素-1等。這些物質均參與快速內皮細胞損傷釋放，血清中上述成分的增加成為內皮細胞損傷的重要標記。vWF是血管內皮細胞和骨髓巨核細胞合成的一種糖蛋白，正常情況下存在于血漿和血小板(占全血15%)中。有研究表明在膿毒癥導致急性腎損傷后，血漿中vWF的表達水平與腎組織內皮細胞的損傷程度直接相關，且其反映活體內皮細胞損傷的早期指標[18]。vWF可與血小板膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ結合，激活GPⅡb/Ⅲa并橋接血小板與vWF,從而促進血小板聚集。vWF還可以介導血小板粘附到內皮細胞損傷后暴露出的膠原表面，使血小板聚集，行成血小板血栓。有研究報道，通過檢測血清vWF的水平，可以判斷嚴重急性腦損傷的程度，結果提示局部腦損傷時vWF的濃度比彌漫性腦損傷時更高；有遲發(fā)性外傷性顱內血腫病人血清vWF濃度比沒有者高；老年腦損傷病人血清vWF濃度比年輕病人更高[19]。

2.2細胞間黏附分子-1它是內皮細胞激活的另一個重要標志物，是介導細胞與細胞外基質之間相互接觸和結合的一類物質。內皮細胞靜息狀態(tài)下細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)呈現陰性表達，而在炎癥和感染時體內大量產生的炎癥介質可引起ICAM-1表達異常增高，ICAM-1增高可促進中性粒細胞和血管內皮細胞的黏附，進一步引起內皮細胞的損傷。因此，ICAM-1的表達同血管內皮的損傷有互相關聯。有研究表明這些黏附分子從胞膜脫落后形成的可溶性成分在血漿中含量增加可作為炎癥和膿毒癥病人血漿中含量均明顯增加，且與全身炎癥反應，器官損傷和病情轉歸有關[20]。此外最近熱門研究用低溫，藥物等手段抑制ICAM-1表達，達到減輕炎癥反應及減少內皮細胞損傷。目前所研究可以抑制ICAM-1表達調控途徑有以下幾種：①通過抑制內皮細胞核轉錄因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化而減少ICAM-1基因的轉錄[21]；②抑制Janus激酶/信號轉導和轉錄活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)磷酸化通路而減少ICAM-1基因的轉錄[22]；③在ICAM-1基因轉錄后通過促進ICAM-1 mRNA降解而減少ICAM-mRNA翻譯成為蛋白質。最新有臨床研究報道可使用雜環(huán)類抗抑郁藥馬普替林可顯著降低脂多糖誘導ICAM-1表達，保護全身內皮細胞起到抗炎作用[23]。

2.3血管生成素-2Ang-2在循環(huán)血中含量增加是一個反映內皮細胞激活和功能障礙以及器官損傷程度的特異指標。酪氨酸激酶受體2(Tyrosine kinase receptors,Tie2)是目前已知的Ang-2的唯一共同體。內皮特異性Ang/Tie2配體-受體系統(tǒng)是內皮細胞激活的重要介質[24]。Ang-1與Tie2結合，使Tie-2的酪氨酸基團發(fā)生磷酸化，現階段研究此可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide3-(OH)/Protein kinase B,PI3K/PKB)，引發(fā)下游的內皮細胞保護信號釋放[25]。也可維持血管內皮鈣粘蛋白的結構和功能，降低NF-κB活性，減少黏附分子表達和抑制內皮細胞凋亡等途徑，保護內皮細胞不受炎癥的損傷減少滲出[26]；而誘導型Ang-2與Tie2結合拮抗Ang-1/Tie2，導致內皮細胞屏障功能的損傷。有實驗研究在缺血缺氧誘導的肺損傷模型中給予外源性Ang-2會導致血漿循化內皮細胞增加，肺組織中性粒細胞浸潤和血管通透性增加，Ang-2基因缺失則炎癥損傷及血管滲漏就減少[27]。Fiedler等[28]學者指出Ang-2不僅可通過活化內皮細胞自分泌過程加重組織低灌注，還可增加內皮細胞對炎癥因子TNF-α的敏感性。在無Ang-2存在時，當TNF-α濃度為40ng/L才能激活內皮細胞損傷，但當Ang-2明顯高于正常值時，TNF-α濃度很低就可致內皮細胞受損并可促進白細胞趨化黏附內皮細胞過程加快。Ang-2在靜息狀態(tài)下血管組織幾乎檢測不到Ang-2 mRNA表達，但內皮細胞損傷激活后其表達明顯上調。有研究表明從正常、無膿毒癥的一般病人、膿毒癥病人和膿毒癥休克病人血中Ang-2含量依次升高，且血中Ang-2含量與病人的組織缺氧程度、動脈血氧分壓、器官損傷程度及預后密切相關,此研究認為Ang-2水平比血管內皮生長因子更能反映膿毒癥時血管內皮細胞損傷導致的肺血管滲漏[29]。因此，內皮細胞特異表達的Ang-2含量增加是危重病人死亡預后的獨立指標。

2.4循環(huán)內皮細胞近年來對內皮細胞損傷研究較熱門的標志物循環(huán)內皮細胞(Circulating endothelial cell,CEC)，顧名思義它是指外周血中測得的血管內皮細胞。正常生理情況下血液中含量極少，而在炎癥、免疫應答、移植和心血管等疾病中可明顯增加，是目前唯一可直接作為組織中反映內皮細胞受損的標志物[30]。最近幾年由于流式細胞術在臨床上的普及，使CEC的檢測變得更加精確。Qamri等[31]研究中發(fā)現在腎移植病人中CEC的含量普遍升高且存在免疫排斥越強者CEC升高程度越明顯，而且在腎穿刺切片中發(fā)現CEC與損傷的內皮細胞呈正相關。另外Fink等[32]在心肺復蘇后缺血再灌注引起的復蘇綜合征中發(fā)現，使用特異性抗原CD146熒光標記的外周血CEC在心臟驟停病人恢復自主循環(huán)后顯著增強，另外發(fā)生在恢復自主循環(huán)后CEC的增加和繼發(fā)的內皮細胞損傷標志物vWF增加水平之間有強相關性，兩者的結合對評估缺血再灌注后血管內皮細胞損傷嚴重程度是個很好的預測指標。

3 結論

內皮細胞的穩(wěn)定性是正常生理功能的基礎，其重要性被廣大學者所認知。內皮細胞損傷是缺血再灌注損傷重要表現之一，同樣內皮細胞損傷也可導致疾病的進一步加重。因此，臨床上就急需某些可方便、快速、敏感的指標來準確的評價內皮細胞損傷的程度從而判斷疾病的進展和預后。內皮細胞特異性標志物的產生和發(fā)展為此提供了很好的切入點，以后這些標志物對血管內皮細胞功能及其調節(jié)的探討將會成為相關疾病研究的熱點。