鄧德耀,袁文麗,張 喚,龍湖波,呂紅玲,沈彥均,王筱棽,楊寶瑞,侯 霞,顧津伊

(昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 云南省第二人民醫(yī)院檢驗科,云南 昆明 650021)

鮑曼不動桿菌因其具有強大的獲得性耐藥和克隆傳播能力而受到廣泛關(guān)注。目前，臨床微生物實驗室多采用自動化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)或生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定不動桿菌，由于醋酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii，不動桿菌基因型3)和醫(yī)院不動桿菌(Acinetobacternosocomialis，不動桿菌基因型13TU)生化表型或蛋白指紋圖譜接近，較難區(qū)分，大多被鑒定并報告為鮑曼不動桿菌。醋酸鈣不動桿菌多分布于自然環(huán)境中，臨床送檢標(biāo)本中分離到的不動桿菌則多為其余三種。鮑曼不動桿菌是醫(yī)院感染常見的條件致病菌，而皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌約占臨床分離醋酸鈣不動桿菌-鮑曼不動桿菌復(fù)合群(Acinetobactercalcoaceticus-Acinetobacterbaumanniicomplex, ACB)的10%～66%[1-4]。需要引起重視的是，上述三種細(xì)菌感染患者的臨床特點可能存在差異[5-6]。關(guān)于鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染的文獻(xiàn)[7-8]較多，本研究重點關(guān)注皮特不動桿和醫(yī)院不動桿菌，回顧性分析其分離患者的臨床資料和實驗室數(shù)據(jù)，探討OXA-51基因擴(kuò)增在臨床ACB快速鑒定中的價值，并對同期分離的皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌進(jìn)行同源性分析。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2016年1—12月分離自云南省第二人民醫(yī)院臨床微生物實驗室335株ACB非重復(fù)菌株，同一患者僅選取首次培養(yǎng)分離的菌株。

1.2 資料收集 收集細(xì)菌培養(yǎng)ACB陽性患者的臨床資料及實驗室檢查結(jié)果，包括：(1)患者的年齡、性別；(2)是否入住重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)，ICU入住天數(shù)，出院或死亡前的住院時間；(3)患者的基礎(chǔ)疾病(肺部疾病、心血管疾病、高血壓、糖尿病)；(4)有創(chuàng)操作，分離前1個月內(nèi)是否行機械通氣(氣管切開和氣管插管)，中央動脈/靜脈置管、留置導(dǎo)尿管≥3 d；(5)對常用抗菌藥物的藥敏情況、多重耐藥菌檢出情況；(6)轉(zhuǎn)歸：是否死亡；(7)分離前最后一次實驗室檢查結(jié)果，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清尿素氮(BUN)、球蛋白。

1.3 方法

1.3.1 主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀、細(xì)菌鑒定卡和藥敏卡由法國BioMerieux 公司生產(chǎn)，培養(yǎng)皿為鄭州安圖生物有限公司生產(chǎn)，抗菌藥物藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品。PCR儀購自北京安杰思，電泳儀、電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。PCR Master Mix試劑購自擎科生物技術(shù)有限公司，引物合成及DNA測序均交由擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗，部分藥敏試驗采用K-B紙片擴(kuò)散法。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922和銅綠假單胞菌 ATCC 27853，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。多重耐藥菌(MDR)判定為對5類抗菌藥物中(第三代頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑)3類或以上抗菌藥物耐藥的細(xì)菌。

1.3.3 細(xì)菌總DNA的提取 煮沸法提取細(xì)菌DNA。

1.3.4 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列分析 引物序列及操作方法參見文獻(xiàn)[9]。

1.3.5 PCR擴(kuò)增OXA-51基因 (1)引物序列，上游引物：5’-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3’，下游引物：5’- TGGATTGCACTTCATCTTGG -3’。(2)反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板5 μL，無核酸酶雙蒸水4 μL。(3)擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，選取部分陽性基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

1.3.6 隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)檢測細(xì)菌同源性 取細(xì)菌DNA模板進(jìn)行同源性分析。(1)引物ERIC-2和DAF4參照文獻(xiàn)[10]合成引物，DAF4：5’-CGGCAGCGCC-3’, ERIC-2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。 (2)反應(yīng)體系(30 μL)：2×PCR Mix 12.5 μL,ERIC-2引物5 μL,DAF4引物5 μL,DNA模板5 μL,無核酸酶雙蒸水2.5 μL。(3) 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性1 min，24℃退火1 min，75℃延伸2 min，共45個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后根據(jù)擴(kuò)增帶的有無統(tǒng)計所有細(xì)菌的二元數(shù)據(jù)。利用NTSYSpc version 2.10e軟件對RAPD電泳結(jié)果進(jìn)行遺傳相似性聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果

2.1 16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列測序比對結(jié)果 335株ACB包括皮特不動桿菌18株，醫(yī)院不動桿菌23株和鮑曼不動桿菌284株，其余10株為不動桿菌屬其他種的細(xì)菌(未列入分組)。

2.2 ACB感染患者臨床資料及實驗室檢查結(jié)果 見表1。

2.3 ACB對11種抗菌藥物的耐藥率 皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌對大部分抗菌藥物的耐藥率均低于鮑曼不動桿菌；皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌對哌拉西林和頭孢他啶的耐藥率高，對其他抗菌藥物的耐藥率則均<50%。皮特不動桿菌與醫(yī)院不動桿菌對11種抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 325例ACB感染患者臨床資料及實驗室檢查結(jié)果

*：與鮑曼不動桿菌感染患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 325株ACB對11種抗菌藥物的耐藥情況

*：與鮑曼不動桿菌耐藥率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；3、18泳道分別為皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌臨床分離株，其余為鮑曼不動桿菌臨床分離株

圖1ACB細(xì)菌OXA-51 基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1Electrophoresis map of amplified product of OXA-51 gene of ACB bacteria

2.4 OXA-51基因擴(kuò)增情況 18株皮特不動桿菌和23株醫(yī)院不動桿菌均未見OXA-51基因擴(kuò)增陽性，284株鮑曼不動桿菌OXA-51基因PCR檢測均陽性。見圖1。

2.5 RAPD同源性分析 遺傳相似性系數(shù)在0.65時，18株皮特不動桿菌可分為克隆A、B、C和D；23株醫(yī)院不動桿菌分為克隆E、F、G和H。其中，克隆A(66.67%)、克隆F(56.52%)分別為皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌的主要克隆。見圖2。

注：a、b分別為皮特不動桿菌的RAPD電泳圖、聚類分析樹狀圖；c、d分別為醫(yī)院不動桿菌的RAPD電泳圖、聚類分析樹狀圖

3 討論

根據(jù)分子遺傳學(xué)技術(shù)，不動桿菌至少可以分為45個基因型，其中28種已正式命名，以前的基因3型現(xiàn)為皮特不動桿菌，基因型13TU為醫(yī)院不動桿菌[11]。在表型上此兩種細(xì)菌與鮑曼不動桿菌十分接近，臨床微生物實驗室使用的商品化鑒定方法常會將其誤鑒定為鮑曼不動桿菌[12-13]，因此，皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌在臨床工作中少見報告。近年來，隨著分子生物學(xué)鑒定方法的普及，越來越多文獻(xiàn)報道臨床分離皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌相關(guān)的醫(yī)院感染[1-4,14]。本研究結(jié)果顯示，鮑曼不動桿菌在ACB中最常見，其次為醫(yī)院不動桿菌，皮特不動桿菌檢出率僅為5.37%。醫(yī)院不動桿菌和皮特不動桿菌占ACB臨床分離株的12.24%，遠(yuǎn)低于以往報道的美國29%[1]、中國(臺灣地區(qū))24%～45%[2]、韓國50%[3]及挪威66%[4]，說明不同國家或地區(qū)醫(yī)院內(nèi)菌群感染的流行方式及種群的進(jìn)化程度不同。國內(nèi)關(guān)于此兩種細(xì)菌臨床分布的文獻(xiàn)報道較少，多中心研究及區(qū)域性細(xì)菌監(jiān)測工作的重要性日益凸顯，有條件的臨床微生物實驗室還應(yīng)積極探索分子遺傳學(xué)鑒定方法，以及應(yīng)用現(xiàn)代質(zhì)譜和測序技術(shù)對醫(yī)院感染復(fù)合菌群及少見菌進(jìn)行鑒定。

不同文獻(xiàn)報道中皮特不動桿菌/醫(yī)院不動桿菌的臨床檢出率存在較大差異，但大多數(shù)研究[1-6]認(rèn)為，與感染鮑曼不動桿菌的患者相比，皮特不動桿菌或醫(yī)院不動桿菌感染患者往往表現(xiàn)出更低的耐藥率和病死率，以及更輕的并發(fā)癥和更好的臨床預(yù)后，因此，鮑曼不動桿菌和皮特不動桿菌/醫(yī)院不動桿菌應(yīng)該被視為不同的種群而區(qū)分對待。在本研究中，分離皮特不動桿菌或醫(yī)院不動桿菌的患者均以男性為主，較鮑曼不動桿菌感染患者而言，此部分患者較年輕，血清球蛋白水平更高，可能具有較強的免疫力，從而抵御毒力較高細(xì)菌的定植與感染。本研究中鮑曼不動桿菌和皮特不動桿菌/醫(yī)院不動桿菌分離患者間ICU入住率、侵入性操作情況、肺部感染率、住院期間死亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與其他文獻(xiàn)[5-6]報道一致。機械通氣往往跨越了咽喉部自然屏障，同時削弱氣道纖毛清除系統(tǒng)功能，氣管導(dǎo)管表面細(xì)菌生物被膜形成，并保護(hù)病原微生物不受抗菌藥物以及宿主防御作用的影響，導(dǎo)致肺部感染的難治和反復(fù)發(fā)生[15]。因此，對于鮑曼不動桿菌感染患者或高危人群，應(yīng)盡早拔管或采用有創(chuàng)-無創(chuàng)序貫通氣策略，減少肺部感染的發(fā)生，進(jìn)而降低患者的病死率。本研究中皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌的MDR率和碳青霉烯類抗生素的使用率均低于鮑曼不動桿菌；除哌拉西林、頭孢他啶和左氧氟沙星外，皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌對其他抗菌藥物，特別是碳青霉烯類抗生素的耐藥率均低于鮑曼不動桿菌，提示臨床實驗室需使用分子遺傳學(xué)方法對ACB進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，有助于臨床醫(yī)生合理選擇抗菌藥物，降低碳青霉烯類抗生素的選擇壓力，縮短住院時間，減輕患者痛苦，降低社會、醫(yī)院、患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

blaOXA-51-like是一大類鮑曼不動桿菌天然攜帶的D類β-內(nèi)酰胺酶基因，多定位在染色體上并具有很高的種屬特異性[16]。然而，也有研究[17]報道含ISAba1-blaOXA-51-like的質(zhì)粒在鮑曼不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌間互相播散。本組皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌均未擴(kuò)增出OXA-51基因，284株鮑曼不動桿菌OXA-51基因PCR檢測均陽性，OXA-51基因擴(kuò)增在快速區(qū)分鮑曼不動桿菌和皮特不動桿菌/醫(yī)院不動桿菌中的敏感性和特異性均為100%，與王賀等[13]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，OXA-51基因擴(kuò)增可以作為一種簡便快捷、成本低廉且易于推廣的技術(shù)，作為臨床微生物實驗室商品化表型鑒定系統(tǒng)的補充。

本研究RAPD分型結(jié)果顯示，遺傳相似性系數(shù)在0.65時，18株皮特不動桿菌和23株醫(yī)院不動桿菌均可分為4個不同的克隆，其中克隆A和克隆F分別為皮特不動桿菌、醫(yī)院不動桿菌的流行株，提示該院存在醫(yī)院內(nèi)皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌的克隆傳播或科室間的交叉感染。根據(jù)RAPD基因分型結(jié)果可以推斷，細(xì)菌克隆株的傳播流行可能是皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌醫(yī)院感染逐年增加的主要原因之一。

皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一，區(qū)域性細(xì)菌耐藥監(jiān)測工作應(yīng)正確區(qū)分該菌群。臨床微生物實驗室開展ACB的準(zhǔn)確鑒定對于病原菌流行病學(xué)調(diào)查具有重要的意義。OXA-51基因擴(kuò)增可以考慮作為一種簡便快捷的分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌的快速鑒定。臨床微生物實驗室應(yīng)加強對皮特不動桿菌和醫(yī)院不動桿菌的檢測和監(jiān)控，以期為臨床合理使用抗菌藥物及控制醫(yī)院克隆株播散提供實驗室依據(jù)。