祁 雪 彭小姍 郭 琰 劉 芳 劉 洋 廖 瓊 朱 渝 吳喜蓉 尹青琴 馬渝燕 饒小春 焦安夏 孫 琳

傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌(MTB)培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足臨床上早期、快速診斷的需求[1，2]。抗酸染色涂片方法無(wú)法區(qū)分MTB和非MTB。同時(shí)，兒童結(jié)核由于載菌量少、標(biāo)本難以采集等特點(diǎn)，臨床很難獲得病原學(xué)診斷的證據(jù)。因此建立新的、準(zhǔn)確性更高的診斷方法，可有效提高兒童結(jié)核病尤其是臨床診斷兒童結(jié)核病的診斷效率。

Xpert MTB/RIF檢測(cè)是一種全自動(dòng)實(shí)時(shí)半巢式核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要用于結(jié)核病的快速檢測(cè)并可同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥[3]。其優(yōu)勢(shì)在于，①可實(shí)現(xiàn)被檢測(cè)靶標(biāo)在短時(shí)間內(nèi)數(shù)百萬(wàn)倍的擴(kuò)增，有效彌補(bǔ)了結(jié)核病患兒標(biāo)本細(xì)菌載量低的問(wèn)題，提高了診斷敏感度；同時(shí)，在疾病早期體內(nèi)細(xì)菌量較少的情況下檢測(cè)，有助于實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷；②可在2 h內(nèi)完成檢測(cè)；③可同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥相關(guān)基因。該方法已被廣泛應(yīng)用于成人結(jié)核病診斷，但在兒童結(jié)核診斷中應(yīng)用相對(duì)較少。而且，兒童結(jié)核通常病原學(xué)陰性，因此該方法在兒童結(jié)核病病原學(xué)診斷中的價(jià)值更高。本文采集支氣管肺泡灌洗液，評(píng)估Xpert MTB/RIF檢測(cè)在兒童肺結(jié)核中的診斷價(jià)值，以期為兒童結(jié)核病診斷提供病原學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 診斷準(zhǔn)確性研究。以支氣管肺泡灌洗液作為病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)本，以病原學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，以臨床診斷活動(dòng)性結(jié)核病為相對(duì)金標(biāo)準(zhǔn)，以Xpert MTB/RIF為待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，考察支氣管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF對(duì)兒童結(jié)核病的診斷價(jià)值。

1.2 倫理 本研究分別通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理號(hào)：2018-96。

1.3 病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 2010年9月10日至2018年9月19日就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院和四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，行纖維支氣管鏡檢查并留取了支氣管肺泡灌洗液的患兒。排除支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本量不足以同時(shí)完成本研究多種方式的病原學(xué)檢測(cè)，或雖行支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本采集但住院時(shí)間少于2 d的患兒。

1.4 病原學(xué)診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn) 有疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，涂片抗酸桿菌檢測(cè)陽(yáng)性和/或分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性且經(jīng)菌種鑒定為MTB復(fù)合群[4]。

1.5 臨床診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn) 有疑似活動(dòng)性結(jié)核病的臨床癥狀和體征，同時(shí)伴胸部影像學(xué)改變及免疫學(xué)檢查(結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)或γ干擾素釋放試驗(yàn))陽(yáng)性，抗結(jié)核治療有效，經(jīng)鑒別診斷排除其他肺部疾病[4]。

1.6 氣管、支氣管結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合本文病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)，存在支氣管鏡下典型的氣管、支氣管內(nèi)膜結(jié)核病變和典型的組織病理學(xué)改變；胸部影像學(xué)檢查符合氣管、支氣管結(jié)核影像學(xué)改變[4]。

1.7 非結(jié)核呼吸道感染性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下條件:①存在確切的其他病原感染證據(jù)(如其他細(xì)菌、病毒、支原體感染等)；②常規(guī)抗炎治療后病情好轉(zhuǎn)或治愈；③存在呼吸系統(tǒng)感染癥狀，且除外結(jié)核病診斷；④診斷為其他呼吸系統(tǒng)感染性疾病。

1.8 Xpert MTB/RIF檢測(cè) 根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。取支氣管肺泡灌洗液0.8～1 mL于無(wú)菌離心管中，1∶1加入配套樣本處理液，<2 mL者加處理液補(bǔ)足2 mL，充分震蕩10～15 s。使用試劑盒內(nèi)提供的專用無(wú)菌移液管，取2 mL處理后樣本由檢測(cè)匣的加樣孔緩慢加入，關(guān)閉檢測(cè)匣的蓋子，置于檢測(cè)模塊，儀器開(kāi)始自動(dòng)檢測(cè)。Xpert MTB/RIF檢測(cè)到MTB目標(biāo)DNA后，基于樣本中MTB的Ct值，間接反映所檢測(cè)樣本中MTB的載量，以高、中、低、極低來(lái)顯示。

1.9 藥物敏感性檢測(cè) 通過(guò)對(duì)利福平耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)MTB菌株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，結(jié)果分為利福平耐藥、不耐藥和不確定結(jié)果。PCR擴(kuò)增該菌株的一線抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因，并通過(guò)一代測(cè)序檢測(cè)其耐藥基因突變情況，包括異煙肼耐藥相關(guān)的靶基因katG、mabA-inhA啟動(dòng)子區(qū)和利福平耐藥相關(guān)的rpoB-RRDR基因。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比進(jìn)行描述。分別以病原學(xué)診斷和臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)四格表計(jì)算Xpert MTB/RIF檢測(cè)方法的診斷性參數(shù)指標(biāo)，組間比較采用卡方檢驗(yàn)(其中兩組間細(xì)菌載量等級(jí)的比較采用行乘列卡方)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的疑似結(jié)核病患兒351例，男198例，女153例，年齡18 d至16歲，平均(5.9±3. 9)歲。診斷肺結(jié)核125例，其中病原學(xué)診斷結(jié)核43例(34.4%)，23例(53.5%)為涂片抗酸桿菌檢測(cè)陽(yáng)性，28例(65.1%)為分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性；臨床診斷結(jié)核82例(65.6%)。肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核51例(40.8%)。非結(jié)核呼吸道感染性疾病226例，其中肺炎支原體肺炎187例(82.7%)，細(xì)菌性肺炎39例(17.3%)。

2.2 Xpert MTB/RIF在兒童肺結(jié)核的診斷參數(shù) 表1顯示，病原學(xué)診斷+臨床診斷結(jié)核敏感度61%(95%CI：52%～69%), 特異度100%(95% CI：98%～100%),陰性預(yù)測(cè)值82%(95%CI:77%～86%)；敏感度病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核(79.1%vs51.2%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.18，P=0.002),特異度均為100%，陰性預(yù)測(cè)值均>85%; 肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核敏感度高于單純肺結(jié)核 (80.4%vs47.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.88，P<0.001),特異度均為100%，陰性預(yù)測(cè)值均>85%。

表1 Xpert MTB/RIF檢測(cè)在兒童肺結(jié)核診斷中的準(zhǔn)確性參數(shù)[% (95% CI)]

病原學(xué)診斷結(jié)核中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性34例，其中極低MTB載量14例(41.2%)、低載量11例(32.4%)、中等載量7例(20.6%)、高載量2例(5.9%)。臨床診斷結(jié)核中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性42例，其中極低MTB載量20例(47.6%)、低載量20例(47.6%)、中等載量2例(4.8%)。根據(jù)Xpert MTB/RIF檢測(cè)的半定量結(jié)果等級(jí)進(jìn)行比較，支氣管肺泡灌洗液的MTB核酸檢出載量病原學(xué)診斷結(jié)核高于臨床診斷結(jié)核，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.37，P=0.025)。

2.3 Xpert MTB/RIF在兒童肺結(jié)核耐藥中的檢測(cè) 76例Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性兒童中，利福平耐藥2例(2.6%)。1例為全身播散性結(jié)核病患兒，予異煙肼、利福平、吡嗪酰胺三聯(lián)抗結(jié)核治療；支氣管灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB載量極低，胃液和支氣管灌洗液標(biāo)本均培養(yǎng)出MTB，同時(shí)行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素的藥物敏感性試驗(yàn)，該菌株對(duì)異煙肼、利福平、乙胺丁醇均耐藥。1例診斷肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核，予異煙肼、利福平二聯(lián)抗結(jié)核治療；支氣管灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB載量中等，胃液、痰液和支氣管灌洗液標(biāo)本均培養(yǎng)出MTB，同時(shí)行異煙肼、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素的藥物敏感性試驗(yàn)，該菌株對(duì)上述藥物均敏感；均未發(fā)生耐藥突變。

3 討論

兒童結(jié)核病因載菌量少等原因往往難以獲得病原學(xué)陽(yáng)性結(jié)果，常為臨床診斷結(jié)核。有研究數(shù)據(jù)顯示，病原學(xué)診斷的兒童結(jié)核<40%，在疑似結(jié)核病兒童中涂片陽(yáng)性率更低(<20%)[5]。我國(guó)最新出版的《肺結(jié)核診斷》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，分子生物學(xué)方法也被作為病原學(xué)診斷的依據(jù)之一[4]。因此，尋找新的分子生物學(xué)方法，評(píng)價(jià)其在我國(guó)兒童結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于提高臨床診斷結(jié)核病檢測(cè)的敏感度十分重要。

Xpert MTB/RIF方法是一種基于全自動(dòng)實(shí)時(shí)半巢式核酸擴(kuò)增為主的技術(shù)，主要用于結(jié)核病的快速檢測(cè)并可同時(shí)檢測(cè)利福平耐藥。2014年WHO頒布的《兒童結(jié)核病管理指南》[6]推薦將其用于兒童結(jié)核病的診斷，建議在疑似兒童結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病以及結(jié)核性腦膜炎兒童腦脊液的檢測(cè)中，其可先于抗酸染色法或細(xì)菌培養(yǎng)法作為初篩；而對(duì)于疑似肺外結(jié)核病的非呼吸道標(biāo)本，在條件允許的情況下，其可作為傳統(tǒng)的抗酸染色、細(xì)菌培養(yǎng)或組織病理學(xué)的替代方法。WHO同時(shí)指出，由于該方法在兒童的研究數(shù)據(jù)較少，部分建議的證據(jù)等級(jí)較低。因此，開(kāi)展Xpert MTB/RIF方法在兒童不同體液和組織標(biāo)本中的臨床價(jià)值研究，對(duì)于推動(dòng)兒童結(jié)核病的早期診斷具有非常重要的臨床意義。

本研究選擇的待測(cè)標(biāo)本類型為支氣管肺泡灌洗液。研究顯示有多種類型的標(biāo)本均可用于Xpert MTB/RIF的檢測(cè)，包括咳出痰或誘導(dǎo)痰、胃液、支氣管肺泡灌洗液、腦脊液、鼻咽分泌物、組織和糞便等。但該方法在不同樣本類型中檢測(cè)的敏感度存在差異；同時(shí)即使同一種類型的樣本，各研究的結(jié)果也差異較大[7-9]。

較多的研究提示，支氣管肺泡灌洗液的敏感度較高。研究中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)在病原學(xué)診斷和臨床診斷結(jié)核患兒中支氣管肺泡灌洗液中敏感度分別為88%和33%[10]。

本研究病原學(xué)診斷結(jié)核患兒中， Xpert MTB/RIF的敏感度為79.1%。盡管分子生物學(xué)原則上具有較高的靈敏度，但在本研究中相對(duì)于培養(yǎng)和抗酸染色，仍有9例為假陰性。原因主要有，①病原學(xué)陽(yáng)性的結(jié)核病患兒均為采集多種類型標(biāo)本(痰液、胃液、支氣管肺泡灌洗液等)且連續(xù)多次采樣進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，任一標(biāo)本陽(yáng)性即診斷為病原學(xué)診斷結(jié)核；而Xpert MTB/RIF檢測(cè)僅采集支氣管肺泡灌洗液且僅進(jìn)行了一次檢測(cè)。②Xpert MTB/RIF檢出MTB的下限是112.6 CFU·mL-1，其靈敏度仍有待進(jìn)一步提高。因此Xpert MTB/RIF檢測(cè)陰性不能除外活動(dòng)性結(jié)核病，要結(jié)合臨床進(jìn)行綜合判斷。在現(xiàn)有試劑盒的基礎(chǔ)上，其二代產(chǎn)品Xpert MTB/RIF Ultra已經(jīng)用于兒童結(jié)核病的診斷。同樣是以支氣管肺泡灌洗液為待測(cè)標(biāo)本，本課題組采用Xpert MTB/RIF Ultra在病原學(xué)診斷結(jié)核病患兒的敏感度可達(dá)到91%[11]。但是相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，分子生物學(xué)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)更在于其快速的特點(diǎn)。相對(duì)于培養(yǎng)4周以上的檢測(cè)周期，Xpert MTB/RIF可以在2～3 h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，非常有助于臨床的早期診斷。

Xpert MTB/RIF在本研究中最為重要的結(jié)果是其在臨床診斷結(jié)核患兒中的價(jià)值。在無(wú)法得到病原學(xué)證據(jù)的82例臨床診斷結(jié)核患兒中，Xpert MTB/RIF仍然能夠在42例患兒中檢出MTB。本課題組前期研究顯示[12]，在初治結(jié)核病患兒中支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF在MTB培養(yǎng)陰性的結(jié)核病患兒中的陽(yáng)性率為33.9%；在抗酸染色陰性的結(jié)核病患兒中的陽(yáng)性率為48.7%。Lu等[13]和Le等[14]研究也顯示，臨床診斷結(jié)核患兒支氣管肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性率分別為48.2%和28.6%，提示支氣管肺泡灌洗液的Xpert MTB/RIF檢測(cè)有助于檢出臨床診斷結(jié)核患兒。如果將Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果作為結(jié)核病確診依據(jù)，可將兒童結(jié)核病的確診率大幅提高，有助于解決兒童結(jié)核病標(biāo)本中細(xì)菌載量低的問(wèn)題。

此外，由于傳統(tǒng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)需要在獲得細(xì)菌菌株后才能進(jìn)行，往往需要>1個(gè)月的時(shí)間獲得結(jié)果，遠(yuǎn)滯后于臨床需求。而分子生物學(xué)方法可以通過(guò)耐藥基因的檢測(cè)彌補(bǔ)耐藥表型檢測(cè)的滯后性。本研究中，76例Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性患兒中，利福平耐藥檢出2例，提示該方法有助于臨床醫(yī)師快速獲得利福平耐藥結(jié)果，有助耐藥結(jié)核病的早期診斷。Xpert MTB/RIF檢測(cè)為利福平耐藥的患兒中，其中1例患兒通過(guò)傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)以及一代測(cè)序技術(shù)未發(fā)現(xiàn)其存在耐藥基因的突變。由于兒童結(jié)核病耐藥率低于成人，培養(yǎng)的陽(yáng)性率也很低，因此難以獲得兒童結(jié)核病耐藥菌株，導(dǎo)致缺乏兒童耐藥相關(guān)數(shù)據(jù)。因此，關(guān)于Xpert MTB/RIF檢測(cè)在兒童耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值仍然需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。