雷琦峰，蔡 維

作者單位:(442000)中國湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院眼科

0 引言

Müller細胞為一種貫穿視網(wǎng)膜全層的放射狀膠質(zhì)細胞，可與感光細胞以及其它的神經(jīng)元緊密相連，可通過降解谷氨酸與攝取谷氨酸－天冬氨酸轉(zhuǎn)運蛋白攝取，從而發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用［1－2］。同時 Müller細胞是一種損傷誘導的干細胞，周圍環(huán)境的變化亦可影響Müller細胞功能［3－4］。絕大多數(shù)活化的Müller細胞都停留在幼稚階段，但是當視網(wǎng)膜下腔膠質(zhì)瘢痕一旦形成，組織低氧壓引起視網(wǎng)膜血管和脈絡膜毛細血管灌注不足，血－視網(wǎng)膜屏障被破壞，加劇感光細胞凋亡［5］。因此研究Müller細胞調(diào)節(jié)機制有助于促進Müller細胞向神經(jīng)元的分化。信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是一類DNA結(jié)合蛋白，廣泛表達于不同類型的細胞和組織中，可參與細胞轉(zhuǎn)化、凋亡、生長、惡性轉(zhuǎn)化等過程［6－8］。阿柏西普是一種融合蛋白，其作為眼科一種新的抗血管生成物，利于減緩濕性黃斑水腫的進展速度，使機體中央視覺維持較長時間，其作用效能強于雷珠單抗或貝伐單抗［9－11］。本實驗探討了阿柏西普對大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞STAT3表達的影響，希望為延緩視網(wǎng)膜色素變性疾病進程提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠永生化視網(wǎng)膜Müller細胞系購自美國Sigma公司(細胞培養(yǎng)在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件:5%CO2、37℃);DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;Annexin V－FITC PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司;MTT增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司;兔抗人多抗［抗AKT抗體(68kD)、抗STAT3抗體(114kD)、抗GAPDH抗體(42kD)］購自英國Abcam公司;HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司;阿柏西普購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期的Müller細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞密度為1×104個/mL(100μL)。按實驗分組，加入不同濃度的阿柏西普100μL(加藥濃度分別為 400、200、100pg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h 后加入 MTT 10μL，6h 后終止培養(yǎng)，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min后，使用酶標儀540nm波長處檢測與計算增殖活性。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期Müller細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板。給予阿柏西普處理48h后收取細胞，加入200μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入10μL Annexin V－FITC和5μL PI雙標記后，避光反應15min，采用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞侵襲 將5μg基質(zhì)膠鋪于侵襲小室聚碳酯微孔膜的上表面，37℃放置30min。Müller細胞經(jīng)阿柏西普處理48h后，在Transwell上室中分別添加細胞100μL，在下室加入到600μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后將其取出，固定并染色微孔膜下層細胞，在400倍光學顯微鏡下任意選取5個視野，對每個視野穿過微孔細胞數(shù)目進行計數(shù)，以侵襲穿透指數(shù)判定侵襲能力。

1.2.4 Western－blot法檢測蛋白表達 Müller細胞經(jīng)阿柏西普處理48h后，收取細胞消化后提取細胞總蛋白，每組取20μg蛋白進行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后過夜封閉，剪成對應大小的條帶放入各含有抗AKT抗體、抗STAT3抗體、抗GAPDH抗體的孵育盒中(稀釋比例為1∶1000)，4℃過夜，TBST洗滌后，再將膜置于相應種屬的二抗中(稀釋比例為1∶5000)，室溫孵育1h，TBST洗滌后進行 ECL顯色，檢測 GAPDH、AKT、STAT3蛋白表達水平。

統(tǒng)計學分析:所有實驗均獨立重復3次，統(tǒng)計學分析采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用珋x±s表示，首先采用單因素方差分析進行三組間的比較，若存在差異，兩兩比較采用 LSD－t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

表1 不同濃度阿柏西普不同時間細胞增殖活性的變化(，%)

表1 不同濃度阿柏西普不同時間細胞增殖活性的變化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普組;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普組。

阿柏西普濃度(pg/mL) 24h 48h 400 28.29±6.10a，c 45.69±5.11a，c 200 43.22±4.19a 66.66±6.44a 100 72.29±5.98 90.82±4.91 F 16.498 22.777 P＜0.01 ＜0.01

表2 不同濃度阿柏西普細胞凋亡率和侵襲穿透指數(shù)的變化(，%)

表2 不同濃度阿柏西普細胞凋亡率和侵襲穿透指數(shù)的變化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普組;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普組。

阿柏西普濃度(pg/mL) 細胞凋亡率 侵襲穿透指數(shù)400 44.58±2.58a，c 9.48±6.33a，c 200 23.19±1.09a 20.17±3.92a 100 5.09±3.11 37.78±2.19 F 19.444 9.222 P＜0.01 ＜0.01

圖1 不同劑量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量阿柏西普作用后細胞增殖活性的變化 處理24、48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的增殖活性下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。

2.2 不同劑量阿柏西普作用后細胞凋亡率的變化 處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的凋亡率逐漸上升，Müller細胞的侵襲穿透指數(shù)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

2.3 不同劑量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表達 處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的AKT蛋白相對表達量無顯著變化(F=0.533，P=0.333);STAT3蛋白相對表達量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.30，P=0.001，圖 1)，兩組間比較，200pg/mL組和100pg/mL組、400pg/mL組差異均有統(tǒng)計學意義(t=8.294、10.482，P=0.012、0.001)。

3 討論

Müller細胞對視網(wǎng)膜發(fā)育和維持自身平衡都具有重要的作用，當前視網(wǎng)膜損傷情況下，Müller細胞可重新回到細胞周期，能夠大量活化和增殖，逆分化為視網(wǎng)膜干細胞，進而轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜各類細胞和神經(jīng)元，完全替代損傷的細胞，恢復視網(wǎng)膜功能［11］。但是在哺乳動物中，Müller細胞的功能受限，只有少量逆分化的Müller細胞分化表達視網(wǎng)膜神經(jīng)元，并能特異地向感光細胞分化［12－13］。

VEGF及其受體(VEGFR)的生成過度表達參與視網(wǎng)膜的損傷過程，嚴重影響患者視力［14］。VEGF為血小板衍生生長因子(PDGF)家族的重要一員，可增加血管通透性與促進血管和淋巴管的生成，是血管內(nèi)皮細胞內(nèi)高度特異性的血管生長和滲透因子［15］。VEGF的類型包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等，其是由七個免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而形成的膜外部分，膜內(nèi)部組成具有酪氨酸激酶活性［16］。VEGF是參與糖尿病黃斑水腫病理生理過程的重要因子，高血糖、缺氧、外在損傷等病理條件可導致VEGF的上調(diào)，從而引起血管增生、血管滲漏等一系列病理過程［17］。阿柏西普的配體結(jié)合域融合了來自VEGF受體1、2及IgG1的Fc部分，其作為一種可溶性誘導受體來結(jié)合VEGF－A和胎盤生長因子，抑制同源VEGF受體的結(jié)合和激活，且阿柏西普與VEGF的親合力高，中和VEGF－A的效能強于雷珠單抗或貝伐單抗［18－19］。本研究顯示細胞處理24、48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的增殖活性下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的凋亡率逐漸上升，Müller細胞的侵襲穿透指數(shù)逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明阿柏西普的應用能降低Müller細胞增殖與侵襲性，提高細胞凋亡率。

當前研究表明，微環(huán)境中的細胞可通過分泌信號分子或者影響細胞間接觸影響干細胞/祖細胞的存活、自我更新、遷移、粘附［20］。STAT3由 750～850個氨基酸組成，分子量為84～113kDa。編碼STAT3的基因在人類定位于第12號染色體，在鼠科動物定位于第11號染色體。STAT3 mRNA在肝臟、睪丸、大腦、心臟和胸腺中含量較高，廣泛表達于不同類型的細胞和組織中［21－22］。STAT3具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZIP)，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、眼科疾病等多種病理生理過程有著密切的關(guān)系［23－24］。STAT3既可抑制轉(zhuǎn)錄，也可活化轉(zhuǎn)錄，其在調(diào)控細胞增殖、凋亡、免疫穩(wěn)態(tài)、炎癥以及器官和組織的分化等方面具有重要功能。研究表明，當Müller細胞受損時細胞凋亡增加，凋亡相關(guān)標記物上調(diào)［25］。本研究顯示處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的AKT蛋白相對表達量無顯著變化(P＞0.05)，STAT3蛋白相對表達量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，表明阿柏西普的應用可影響STAT3蛋白的表達。從機制上分析，阿柏西普可阻止VEGF與Fit－1的結(jié)合，抑制同源VEGF受體的結(jié)合和激活，從而抑制STAT3蛋白的表達。本研究也有一定的不足，沒有對阿柏西普的空白對照進行分析，也沒有明確阿柏西普的作用位點，將在下一步的實驗中進行深入分析。

總之，阿柏西普可抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞STAT3蛋白表達，從而抑制細胞增殖與侵襲性，促進細胞凋亡。