羅永鋒，李 蓉，王 強(qiáng)，姚 楊

作者單位:1(467100)中國河南省郟縣光明眼科醫(yī)院;(710077)中國陜西省西安市，西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 2眼科;3感染控制科;4中心實(shí)驗(yàn)室

0 引言

細(xì)胞自噬是一種普遍存在于真核生物中的溶酶體降解途徑，能對損傷的細(xì)胞器和毒性蛋白聚合物等細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行包裹、消化、降解和再利用，以滿足細(xì)胞自身的代謝需要以及細(xì)胞器的更新［1－2］。自噬在衰老、腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性疾病中起重要作用，故已成為目前生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。炎癥反應(yīng)的發(fā)生在很大程度上與細(xì)胞自噬存在密切關(guān)聯(lián)，其機(jī)制涵蓋多個(gè)方面，并且在眼科疾病中可能發(fā)揮重要作用［3］。

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是一種具有多種復(fù)雜生理生化功能的色素細(xì)胞，分泌的多種生長因子可影響神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞及其自身的生理特性，也與眼部疾病的發(fā)生密切相關(guān)［4］。在正常生理?xiàng)l件下，炎性細(xì)胞因子主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，病理?xiàng)l件下神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、RPE細(xì)胞等也可分泌［5］。炎性因子 IL－1β和 IL－6具有多種生物功能活性，與機(jī)體免疫、各種器官的生理功能有關(guān)，目前對于RPE細(xì)胞表達(dá)IL－1β和IL－6與細(xì)胞自噬的關(guān)系尚不清楚。LC3、Beclin－1和p62等是參與自噬體或自噬溶酶體形成的關(guān)鍵蛋白，近年來作為自噬標(biāo)記物被廣泛用于相關(guān)研究中［6－7］。3－甲基腺嘌呤(3－MA)和氯喹(CQ)是兩種應(yīng)用廣泛的自噬抑制劑，分別作用于自噬的早期和晚期階段。基于此，本研究觀察細(xì)胞自噬在缺氧條件下RPE細(xì)胞表達(dá)IL－1β和IL－6中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 ARPE－19細(xì)胞系(武漢普諾賽生命科技有限公司);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司);3－MA(美國Selleck公司);CQ(美國Sigma公司);兔抗人LC3B多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人Beclin－1多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人p62多克隆抗體(美國CST公司);兔抗人GAPDH多克隆抗體(杭州賢至生物有限公司);HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);人IL－1β和IL－6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)。三氣培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF－100型);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，IX51型);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Thermo scientific公司，Multiskan MK3型)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用不含EDTA的0.25%胰酶消化ARPE－19細(xì)胞，用含10%FBS+1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打混勻成單細(xì)胞懸液，傳代至培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞(5～10代)接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組、正常對照組，其中缺氧組細(xì)胞置于 O2∶CO2∶N2體積比為 1∶5∶94 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;3－MA+缺氧組細(xì)胞先用10mmol/L 3－MA預(yù)處理2h，然后處理方法同缺氧組;CQ+缺氧組細(xì)胞先用50μmol/L CQ預(yù)處理2h，然后處理方法同缺氧組。對照組細(xì)胞在正常氧條件下培養(yǎng)。

1.2.2 ELISA 所有分組的細(xì)胞因子均采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定分析方法(ELISA)進(jìn)行檢測，具體參照說明書進(jìn)行操作。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液100μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μL。酶標(biāo)板覆膜，36℃孵育90min。充分洗板后空白孔加入生物素化抗體稀釋液，其余孔中加入生物素化抗體工作液100μL，覆膜后36℃溫育1h。充分洗板后向空白孔加入酶結(jié)合稀釋液，其余孔加酶結(jié)合物工作液100μL，覆膜后36℃溫育30min。洗板后每孔加顯色劑(TMB)100μL，酶標(biāo)板加上覆膜在37℃避光孵育15min，每孔加終止液100μL，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.2.3 Western blot 細(xì)胞處理完成之后，棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS漂洗3次，加400μL含PMSF的裂解液使細(xì)胞充分裂解，離心提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。30%丙烯酰胺SDS－PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液常溫封閉2h;一抗孵育:將膜分別放入稀釋好的抗體 LC3B(1∶1000)、Beclin－1(1∶1000)、p62(1∶1000)及 GADPH(1∶1000)中，4℃搖床過夜。用TBST洗膜3次，每次10min;二抗孵育:將膜放入用稀釋液稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗(1∶50000)中避光常溫孵育1～2h。用TBST洗膜3次，每次10min;ECL顯色曝光，掃描膠片后使用BandScan系統(tǒng)軟件分析蛋白條帶。將目的蛋白LC3B、Beclin－1和p62與內(nèi)參GAPDH灰度的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)均在不同時(shí)間3次生物學(xué)重復(fù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARPE－19細(xì)胞形態(tài) 培養(yǎng)24h在倒置顯微鏡下觀察，ARPE－19細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)扁圓形、梭形、多角形或者不規(guī)則形，貼壁良好，胞漿內(nèi)未見明顯黑色素顆粒。不同組之間的細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異，見圖1。

2.2 各組RPE細(xì)胞表達(dá)IL－1β及IL－6的濃度比較 IL－1β和IL－6濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)及相應(yīng)的濃度方程為:y=(－0.2463+311.0454x)/(1+0.1937x－0.1366x2)，y=(0.9089+117.3496x)/(1－0.4715x+0.0727x2)，獲得各組細(xì)胞上清液中IL－1β和IL－6的濃度。ELISA結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞在未受到刺激的情況下僅僅產(chǎn)生少量的IL－1β和IL－6。缺氧刺激之后，上清液中IL－1β和IL－6的產(chǎn)量迅速增加，3－MA或CQ可以明顯抑制IL－1β和IL－6的產(chǎn)生(圖3)。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細(xì)胞的 IL－1β 濃度分別為 195.01±5.62、167.80±3.15、131.78±5.38、98.37±5.49pg/mL，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=211.89，P＜0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺氧組的IL－1β濃度明顯高于對照組、3－MA+缺氧組和 CQ+缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細(xì)胞的IL－6濃度分別為252.32±12.48、165.45±10.13、90.07±5.37 和 53.13±2.60pg/mL，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=317.15，P＜0.01)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺氧組的IL－6濃度明顯高于對照組、3－MA+缺氧組和CQ+缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖3。

圖1 倒置顯微鏡下觀察ARPE－19細(xì)胞形態(tài)(×100) A:對照組;B:缺氧組;C:3－MA+缺氧組;D:CQ+缺氧組。

圖2 IL－1β及 IL－6的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 A:IL－1β;B:IL－6。

圖3 ELISA檢測 IL－1β及IL－6濃度的統(tǒng)計(jì)柱狀圖 A:IL－1β;B:IL－6。bP＜0.01 vs缺氧組。

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞LC3B、Beclin－1和 p62的蛋白條帶圖。

2.3 各組RPE細(xì)胞自噬水平的比較 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，缺氧組細(xì)胞自噬激活，表現(xiàn)為LC3B－Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin－1這兩種蛋白條帶增強(qiáng)和 p62蛋條帶減弱。與缺氧組比較，當(dāng)采用自噬抑制劑3－MA預(yù)處理細(xì)胞，LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表達(dá)則明顯降低，p62的表達(dá)明顯升高;采用自噬抑制劑 CQ預(yù)處理細(xì)胞，Beclin－1的表達(dá)明顯降低，LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表達(dá)明顯升高，見圖4。缺氧組、3－MA+缺氧組、CQ+缺氧組及對照組細(xì)胞中的LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1及p62的相對蛋白表達(dá)量分別為(0.50±0.05、0.34±0.01、0.67±0.05 和 0.24±0.02)、(0.97±0.05、0.78±0.06、0.54±0.01 和 0.32±0.03)和(0.32±0.10、0.78±0.08、0.96±0.02 和 1.03±0.02)。組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LC3B－Ⅱ/Ⅰ:F=80.65，P＜0.01;Beclin－1:F=139.29，P＜0.01;p62:F=70.64，P＜0.01)。之后兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺氧組細(xì)胞中LC3B－Ⅱ/Ⅰ和Beclin－1的相對蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組和3－MA+缺氧組，缺氧組中LC3B－Ⅱ/Ⅰ的相對蛋白表達(dá)量低于CQ+缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。缺氧組細(xì)胞中p62相對蛋白表達(dá)量明顯低于對照組、3－MA+缺氧組和CQ+缺氧組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖5。

3 討論

RPE細(xì)胞是一種具有多種復(fù)雜生理生化功能的色素細(xì)胞，在眼的發(fā)育和視覺功能中起著非常重要的作用［8］。在疾病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變，其中RPE細(xì)胞是病變的中心環(huán)節(jié)，其結(jié)構(gòu)或功能異常會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞功能受損、視網(wǎng)膜退化等疾病的發(fā)生。研究證實(shí)，RPE細(xì)胞是參與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性及糖尿病視網(wǎng)膜病變等的主要細(xì)胞，它分泌的IL－1β、IL－6等炎性因子在趨化細(xì)胞移動(dòng)、啟動(dòng)細(xì)胞增生、分泌膠原和纖維血管膜形成中可能發(fā)揮重要作用［9－12］。RPE 受刺激后能分泌 IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、干擾素－γ和單核細(xì)胞趨化蛋白－1等多種炎性細(xì)胞因子［13］。上述眼底疾病的發(fā)生與缺氧、慢性炎癥密切相關(guān)。本研究以ARPE－19細(xì)胞(廣泛用于眼底疾病研究的一種細(xì)胞模型)為研究對象，也發(fā)現(xiàn)在缺氧刺激條件下，RPE細(xì)胞分泌IL－1β、IL－6的水平升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符。

圖5 各組細(xì)胞LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1和p62蛋白相對表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)柱狀圖 A:LC3B－Ⅱ/Ⅰ蛋白;B:Beclin－1蛋白;C:p62蛋白。bP＜0.01 vs缺氧組。

作為普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種機(jī)制，細(xì)胞自噬能對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定進(jìn)行自我維持，且在生長、發(fā)育等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，多種代謝應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬激活［1］。作為自噬標(biāo)記蛋白，LC3、Beclin－1 和 p62 等被廣泛用于自噬的研究中。LC3是自噬相關(guān)蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物的類似物，參與前體膜的延長和閉合，也參與自噬體的形成，故ATG8/LC3是自噬的重要分子標(biāo)記物［14］。LC3在其C末端被ATG4剪切，形成LC3－Ⅰ。LC3－Ⅰ通過ATG7和ATG3與磷脂酰乙醇胺相結(jié)合形成酯化產(chǎn)物L(fēng)C3－Ⅱ，特異性結(jié)合于自噬體膜上。LC3－Ⅱ始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合。Beclin－1是自噬相關(guān)蛋白ATG6在哺乳動(dòng)物的類似物，是其他自噬蛋白基因參與自噬形成過程的必須成分［15］，當(dāng)自噬被抑制時(shí)，Beclin－1的表達(dá)降低。p62/SQSTM1蛋白是一種同LC3相互作用的蛋白，對降解底物的識(shí)別和包裹起著關(guān)鍵作用，p62的蛋白表達(dá)越低，說明底物降解越少，則自噬活性越強(qiáng)，即p62的水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［16］。由于LC3抗體對LC3－Ⅱ具有更高的親和力，會(huì)造成假陽性結(jié)果，因此判斷自噬活性的強(qiáng)弱還需同時(shí)考慮溶酶體活性的影響。在研究中需要結(jié)合LC3－Ⅱ及p62的蛋白表達(dá)綜合判斷自噬活性的強(qiáng)弱。本研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，RPE細(xì)胞的LC3B－Ⅱ/Ⅰ(LC3B是LC3的主要亞型)、Beclin－1蛋白表達(dá)增加及p62蛋白表達(dá)下降，證實(shí)缺氧誘導(dǎo)了RPE細(xì)胞的自噬激活。

眾所周知，視網(wǎng)膜對缺氧及繼發(fā)的氧化應(yīng)激高度敏感，故各種缺血性視網(wǎng)膜疾病，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等都與缺氧密切相關(guān)。因此，本研究將缺氧作為刺激條件，觀察RPE細(xì)胞功能與其自噬水平的關(guān)系。鑒于不同自噬抑制劑的作用機(jī)制存在差異，在本研究中我們采用了兩種自噬抑制劑對RPE細(xì)胞進(jìn)行了干預(yù)，以避免使用某一種抑制劑可能帶來的結(jié)果偏差。其中，3－MA是一種應(yīng)用廣泛的自噬抑制劑，它作用于自噬誘導(dǎo)階段，特異性阻斷自噬體的形成［17］，故作用后 LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表達(dá)降低，p62的表達(dá)升高(不能被降解);CQ是一種溶酶體自噬抑制劑，可以阻止晚期階段自噬體與溶酶體的結(jié)合，抑制自噬的降解，使得自噬體在細(xì)胞內(nèi)增加，作用后會(huì)使LC3－Ⅰ向LC3－Ⅱ的轉(zhuǎn)換增加更為明顯［18］，故作用后LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表達(dá)升高，而Beclin－1的表達(dá)降低(自噬過程被抑制)。10mmol/L是用3－MA處理ARPE－19 細(xì)胞的常用濃度［19－20］，故本研究也采用了這一濃度。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，10～30μg/mL CQ不會(huì)影響細(xì)胞活力和代謝，且10～20μg/mL的濃度對細(xì)胞活力的影響無明顯差異［21］。另一研究提示，10μmol/L CQ 作用于ARPE－19細(xì)胞24h不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而在250μmol/L時(shí)幾乎100%的細(xì)胞死亡，預(yù)測LD50介于100～120μmol/L之間［22］。因此，本研究選擇 50μmol/L(即 16μg/mL)濃度的CQ來抑制自噬也是合理的。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧刺激可促進(jìn)RPE細(xì)胞表達(dá)IL－1β、IL－6，3－MA或 CQ處理后減少了二者的表達(dá)。3－MA和CQ預(yù)處理得到的結(jié)果一致，證明抑制自噬能減少RPE細(xì)胞表達(dá)IL－1β和IL－6。

IL－1β是IL－1家族成員之一，是細(xì)胞間信號(hào)傳遞的基本的介質(zhì)，具有多種生物功能活性，例如促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生、透明質(zhì)酸酶和前膠原的合成等［5，23］。IL－6是一種單鏈糖蛋白，是與機(jī)體免疫、各種器官生理功能有關(guān)的多向性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)化及免疫反應(yīng)［24－25］。目前，越來越多的研究認(rèn)為自噬與機(jī)體免疫和炎癥有著密切的關(guān)系，但在眼科的相關(guān)研究較少［3，26］。因此，本研究觀察了不同刺激條件下RPE細(xì)胞分泌IL－1β和IL－6的情況及其與細(xì)胞自噬的聯(lián)系。結(jié)果表明，在缺氧刺激條件下 RPE細(xì)胞自噬激活，表現(xiàn)為LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1 表達(dá)增強(qiáng)，p62 表達(dá)減弱，同時(shí)細(xì)胞分泌IL－1β和IL－6的水平升高，且采用自噬抑制劑3－MA和 CQ能夠減少 IL－1β和 IL－6的表達(dá)。鑒于IL－1β和 IL－6在纖維增生等病理過程中起重要作用［27－28］，我們推測缺氧誘導(dǎo)自噬激活并促進(jìn) RPE細(xì)胞分泌IL－1β和IL－6，可能是這些炎性因子參與多種眼底疾病病理過程的重要機(jī)制。不過，自噬對RPE細(xì)胞分泌IL－1β和IL－6的具體調(diào)控機(jī)制，以及對纖維增生性眼病的確切影響還需進(jìn)一步研究。