李長(zhǎng)路

(廣州蕊特生物科技有限公司，廣州510000)

目前，在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本，減少生物制品純化損失，減少由于不確定蛋白或血清組分帶來干擾或差異的風(fēng)險(xiǎn)，提高生物制品的安全性，大多數(shù)采用無血清培養(yǎng)基［1－2］。但在使用過程中，有些病毒，如口蹄疫病毒有時(shí)會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但病毒產(chǎn)量不高的問題。為了克服這一問題，許多廠家在病毒生產(chǎn)過程中，還是要加入1%～3%的低濃度血清。為了研究胎牛血清中的哪些組分對(duì)病毒復(fù)制起促進(jìn)作用，我們采用親和凝膠層析方法分離出四個(gè)血清組分，分別配制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)SF9細(xì)胞，接種昆蟲桿狀病毒，進(jìn)行空斑測(cè)定病毒滴度、流式檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)［3］。如果能把血清中不同組分對(duì)病毒復(fù)制的影響分析清楚，即哪些組分對(duì)病毒復(fù)制起促進(jìn)作用，哪些組分起抑制作用，從而在疫苗生產(chǎn)中，加入對(duì)病毒復(fù)制起促進(jìn)作用的血清組分，去除那些對(duì)病毒復(fù)制有抑制作用的組分，可以有效提高疫苗產(chǎn)量。目前，提高病毒復(fù)制的方法主要集中在細(xì)胞馴化和病毒自身改造，血清中不同組分對(duì)病毒復(fù)制的影響，還未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從胎牛血清中分離出五個(gè)混合組分，培養(yǎng)昆蟲桿狀病毒，觀察不同組分對(duì)病毒復(fù)制效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清FBS:廣州蕊特生物科技有限公司，批號(hào) 20180318;胎牛血清樣本 S1、S2、S3、S4:用welchrom 4B填料，分別從上述同一批號(hào)胎牛血清FBS中分離獲得的混合組分，廣州蕊特生物科技有限公司提供;培養(yǎng)基:Grace＇s培養(yǎng)液，批號(hào)20150709;細(xì)胞:ATCCSF－9，批號(hào) 20180810，代次41;病毒:BAC－GFP V6，滴度 1.08×107PFU/mL，由廣東華南疫苗股份有限公司提供;流式細(xì)胞儀:C6、BD Bioscience。

1.2 方法 在6孔板上接種SF9細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，接種 0.01MOI的 BAC－GFP 病毒;按照 0、0.3%、0.6%、1.3%、2.5%、5%的 FBS 組分的濃度梯度加入6孔板中進(jìn)行病毒培養(yǎng)，原胎牛血清FBS做對(duì)照;分別在 24 h、48 h、72 h、96 h 進(jìn)行熒光拍照(40×)，觀察病毒復(fù)制情況;96 h收集病毒上清，進(jìn)行空斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度(稀釋度=10－4)，收集的病毒感染SF9細(xì)胞，72 h流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒的復(fù)制情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 空斑實(shí)驗(yàn)觀察病毒復(fù)制結(jié)果 通過空斑測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與FBS對(duì)比，S1樣本濃度在1.3%以上時(shí)，空斑數(shù)顯著增加。S2樣本的空斑數(shù)沒有增加，反而降低。S3樣本濃度在2.5%以上時(shí)，空斑數(shù)顯著增加，沒有S1顯著。S4樣本的空斑數(shù)變化無顯著差異。結(jié)果見表1、圖1－圖5。

表1 不同濃度血清樣本的空斑數(shù)Tab 1 Plaque assay of different concentration

2.2 熒光強(qiáng)度觀察病毒復(fù)制結(jié)果 通過肉眼觀察熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，與FBS對(duì)比，S1樣本隨著濃度升高，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。S2樣本的熒光強(qiáng)度沒有增加。S3樣本濃度在2.5%以上時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。S4樣本的熒光強(qiáng)度沒有明顯變化。結(jié)果見圖 6－圖 10。

圖1 空斑數(shù)比較圖(0.3%)Fig 1 BAC Plaque(0.3%)

圖2 空斑數(shù)比較圖(0.6%)Fig 2 BAC Plaque(0.6%)

圖3 空斑數(shù)比較圖(1.3%)Fig 3 BAC Plaque(1.3%)

圖4 空斑數(shù)比較圖(2.5%)Fig 4 BAC Plaque(2.5%)

圖5 空斑數(shù)比較圖(5%)Fig 5 BAC Plaque(5%)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果病毒復(fù)制結(jié)果 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與FBS對(duì)比，S1樣本濃度在1.3%以上時(shí)，病毒數(shù)量顯著增多。S2樣本的病毒數(shù)量沒有顯著增加。S3樣本濃度在2.5%以上時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增多。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)S4對(duì)病毒復(fù)制沒有明顯促進(jìn)作用，故沒有進(jìn)行流式檢測(cè)。結(jié)果見圖 11－圖 13。

3 討論

昆蟲桿狀病毒是一種共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其特有的Bac－to－Bac表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后加工修飾功能和高效表達(dá)外源蛋白的功能。本文選擇病毒培養(yǎng)96 h，滴度達(dá)到最大值，可以收集病毒上清，感染細(xì)胞后，72 h病毒滴度達(dá)到最大值，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

圖6 添加血清或組分濃度為0.3%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強(qiáng)度Fig 6 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.3%，at 96 h

圖7 添加血清或組分濃度為0.6%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強(qiáng)度Fig 7 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 0.6%，at 96 h

圖8 添加血清或組分濃度為1.3%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強(qiáng)度Fig 8 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 1.3%，at 96 h

圖9 添加血清或組分濃度為2.5%，培養(yǎng)病毒96 h的熒光強(qiáng)度Fig 9 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 2.5%，at 96 h

圖10 添加血清或組分濃度為5%，培養(yǎng)病毒96h的熒光強(qiáng)度Fig 10 The fluorescence intensity of Five samples with serum or components at 5%，at 96 h

圖11 S1的流式檢測(cè)Fig 11 The FC of S1

圖12 S2的流式檢測(cè)Fig 12 The FC of S2

圖13 S3的流式檢測(cè)Fig 13 The FC of S3

綜合蝕斑實(shí)驗(yàn)、熒光拍照以及流式檢測(cè)結(jié)果，血清樣本 S1、S2、S3、S4中，S1與 S3對(duì)BAC增殖的促進(jìn)作用最為明顯，而S2對(duì)BAC增殖存在抑制，S4存在微弱的促進(jìn)效果。結(jié)果表明，血清中的有些組分對(duì)病毒復(fù)制起促進(jìn)作用，有些組分反而抑制病毒復(fù)制。在病毒培養(yǎng)過程中，添加S1組分，同時(shí)去除血清中的S2組分，可以有效提高病毒復(fù)制效率，提高病毒產(chǎn)量，這對(duì)疫苗生產(chǎn)有幫助。

在生物制品中，使用無血清培養(yǎng)基，可提高生物制品的質(zhì)量、純度，方便產(chǎn)物的分離純化，減少由血清帶來的污染機(jī)會(huì)，減少過敏原，同時(shí)也減少了成本，也便于在生物反應(yīng)器中進(jìn)行代謝流分析，實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)控，精準(zhǔn)投料。對(duì)于生產(chǎn)抗體用的CHO細(xì)胞、vero 細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，確實(shí)有優(yōu)勢(shì)［4－5］。但是對(duì)于多數(shù)病毒性疫苗來說，會(huì)出現(xiàn)病毒產(chǎn)量低的情況。

對(duì)于如何在減少或不用血清的情況下，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，病毒產(chǎn)量高，是目前研究的熱點(diǎn)，主要集中在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行馴化和對(duì)病毒自身進(jìn)行改造兩方面。通過對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行低血清或無血清馴化，獲得可以穩(wěn)定傳代的懸浮細(xì)胞，用于細(xì)胞反應(yīng)罐生產(chǎn)。田波等［6］對(duì)BHK21細(xì)胞懸浮馴化，篩選出馴化的參數(shù)條件。張良艷等［7］對(duì)MDCK細(xì)胞進(jìn)行馴化，用于流感病毒發(fā)酵罐培養(yǎng)。通過對(duì)病毒的啟動(dòng)子進(jìn)行改造，提高病毒復(fù)制能力。劉言等［8］用HBV病毒啟動(dòng)子內(nèi)的基因片段替換土撥鼠肝炎病毒的同源序列，來提高病毒復(fù)制能力。袁天罡［9］把口蹄疫病毒的2C蛋白的T135I突變，從而提高O/YS/CHA/05的復(fù)制。魏南南、徐守興等［10］利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了內(nèi)源性TPL2基因?qū)谔阋卟《緩?fù)制的影響，發(fā)現(xiàn)FMDV感染BHK－21細(xì)胞后，TPL2轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào);過表達(dá)TPL2能夠促進(jìn)FMDV在BHK－21細(xì)胞中復(fù)制，而下調(diào)表達(dá)內(nèi)源性TPL2后FMDV的復(fù)制受到抑制，表明TPL2促進(jìn)FMDV在BHK－21細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。謝佳汛［11］使用p53特異性抑制劑PFTɑ提前處理PK－15細(xì)胞，抑制p53的表達(dá)，然后用PRV分別感染p53抑制表達(dá)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞，收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，檢測(cè)PRVgB基因和PRV滴度，結(jié)果表明p53抑制表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的PRVgB基因及病毒TCID50均顯著低于對(duì)照組，說明抑制p53的表達(dá)對(duì)PRV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制具有抑制作用。王濤［12］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，COPⅡ蛋白復(fù)合體促進(jìn)CSFV復(fù)制的過程，COPⅡ介導(dǎo)的蛋白運(yùn)輸途徑促進(jìn)CSFV的組裝或釋放，為進(jìn)一步探索COPⅡ在CSFV復(fù)制中的作用奠定了基礎(chǔ)，為全面了解CSFV復(fù)制機(jī)制和生命周期提供了新的科學(xué)依據(jù)。本文研究從胎牛血清中分離不同組分對(duì)病毒復(fù)制的影響，初步證實(shí)分離出的組分S1對(duì)昆蟲桿狀病毒復(fù)制有明顯的促進(jìn)作用。至于該組分是否對(duì)其它病毒復(fù)制有同等的促進(jìn)作用，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步去驗(yàn)證。