黃賢克,查珊潔,劉廣緒,張敏,肖國強,閆茂倉,胡利華*

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飼喂沙蠶、烏賊對凡納濱對蝦生長性狀及供能基因表達(dá)的影響

黃賢克1,查珊潔2,劉廣緒2,張敏1,肖國強1,閆茂倉1,胡利華1*

1. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005 2. 浙江大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058

運用熒光定量PCR等技術(shù)，本研究對比分析了飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雌、雄凡納濱對蝦體長、體重、肌肉重、含肉率等10個生長性狀的影響，并探討了不同生物餌料飼喂對雌、雄凡納濱對蝦關(guān)鍵代謝供能基因己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、異檸檬酸脫氫酶（IDH）和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT1)表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，飼喂雙齒圍沙蠶具有顯著的促進(jìn)凡納濱對蝦生長的作用，雄性的體長、體重、頭甲長、頭甲寬、肌肉重、軀體周長顯著高于對照組，雌性的體長、頭甲長、頭甲寬和軀體周長也顯著增加；飼喂烏賊組的雄性凡納濱對蝦，雖然生長性能與對照組并無顯著差別，但體型更為細(xì)長（BL/BW顯著大于對照組，<0.05），而頭部較為粗壯（HL/HW顯著小于對照組，<0.05）。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雌、雄凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因的表達(dá)具有顯著影響。

生物餌料; 凡納濱對蝦; 生長; 基因表達(dá)

凡納濱對蝦（）俗稱南美白對蝦，因其具有頭胸甲小、含肉率高、抗逆性強、生長快、繁殖期長、耐高密度和低鹽度養(yǎng)殖、便于活體運輸?shù)葍?yōu)點，是目前世界對蝦養(yǎng)殖的三大品種之一[1-3]。自上世紀(jì)80年代末成功引入我國后，凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，逐步成為全國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一[3-5]。以浙江省為例，2014年，全省凡納濱對蝦養(yǎng)殖面積約40余萬畝，產(chǎn)量約11.2萬t（其中，淡水8.07萬t，海水3.10萬t），產(chǎn)值達(dá)45億元，已成為浙江省第二大水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。因此開展相關(guān)營養(yǎng)代謝等基礎(chǔ)研究，對解決凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中存在的現(xiàn)實問題具有重要的指導(dǎo)意義[6]。

凡納濱對蝦的生物餌料沙蠶、烏賊具有EPA、DHA、蛋白質(zhì)含量高，易于消化吸收等特點[7-9]，在養(yǎng)殖中被廣泛用于提高幼蝦成活率、加速蝦體生長和促進(jìn)親蝦性腺發(fā)育[9,10]。目前對蝦生物餌料沙蠶、烏賊的營養(yǎng)成分組成已經(jīng)研究的較為透徹[9,11]，少量相關(guān)研究也分析了生物餌料飼喂對凡納濱對蝦生長性能的影響[12]，然而詳細(xì)系統(tǒng)的對比分析仍然缺乏。而且，到目前為止仍未見從基因表達(dá)角度分析生物餌料飼喂對凡納濱對蝦代謝供能分子通路影響的研究報道。

生物體主要通過三羧酸循環(huán)、糖酵解和氧化磷酸化分子途徑進(jìn)行三大營養(yǎng)物質(zhì)（糖、脂、蛋白質(zhì)）的代謝，從而為生物體的正常生命活動提供能量[13]。其中糖酵解途徑是機(jī)體糖類物質(zhì)代謝的主要方式，己糖激酶(hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是該過程中重要的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶[14,15]。HK催化由葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸的放熱反應(yīng)，對整個糖酵解過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[13]；而PK則是糖酵解途徑中重要的限速酶之一，其活力在一定程度上可以反映糖酵解水平的高低[13,15]。三羧酸循環(huán)中，異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate dehydrogenase, IDH）催化三羧酸循環(huán)第一次氧化脫羧生成CO2的不可逆反應(yīng)，因此是三羧酸循環(huán)中的主要限速酶[13,16]。此外，在脂肪酸氧化供能過程中，肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶(Carnitine palmitoyltransferase 1, CPT1)催化長鏈脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)移到肉毒堿上這一生命過程，是該過程的重要限速酶[13,17]。

為探明不同生物餌料（沙蠶、烏賊）對凡納濱對蝦生長性能和機(jī)體代謝供能的影響，本研究運用熒光定量PCR等技術(shù)手段，對比分析了飼喂沙蠶、烏賊對雌雄凡納濱對蝦體長、體重、肌肉重、含肉率等10個生長性狀指標(biāo)的影響，并探討了不同生物餌料飼喂下PK、HK、IDH、CPT1基因表達(dá)的情況。本研究結(jié)果將有助于豐富凡納濱對蝦分子代謝與營養(yǎng)相關(guān)知識體系，為凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)合理選擇生物餌料提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 凡納濱對蝦的獲得與暫養(yǎng)

體格均一的浙桂1號凡納濱對蝦（體長9.67±0.30 cm，體重10.05±0.5 g）于2016年7月初取自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江試驗場。試驗前，對蝦置于6 t水體室內(nèi)養(yǎng)殖池內(nèi)暫養(yǎng)7 d，期間水溫、pH、鹽度分別控制在28.8±0.6 oC、8.3±0.2和29.8±0.4。每天分別于8:00、12:00、16:00和22:00投喂商業(yè)化對蝦飼料4次，并于18:00換水（1/3水體）1次。

1.2 生物餌料飼喂試驗

試驗選取營養(yǎng)成分組成背景較為明晰的雙齒圍沙蠶（）[8]和杜氏槍烏賊（）[9]作為生物餌料，以商業(yè)化對蝦飼料為對照。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在綜合考慮實際攝食效果情況下，分別設(shè)置對照組（僅投喂商業(yè)化對蝦飼料）、烏賊添加試驗組（1/2對蝦飼料+1/2冰鮮杜氏槍烏賊，重量比）和沙蠶投喂試驗組（僅投喂活體雙齒圍沙蠶）。試驗在1噸水體養(yǎng)殖桶內(nèi)進(jìn)行，每組設(shè)置三個平行重復(fù)，各放置經(jīng)過暫養(yǎng)的凡納濱對蝦50尾。分別于8:00、12:00、16:00和22:00投喂對應(yīng)生物餌料或飼料，每次投喂量為蝦體初始體重的1/15。試驗周期15天，試驗過程中保持水體環(huán)境溫度（28.8±0.6 oC）、pH（8.3±0.2）、鹽度（29.8±0.4）相對穩(wěn)定，并于每天18:00換水（1/3水體）1次。

1.3 生長性狀測定

飼喂試驗結(jié)束后，每平行組隨機(jī)選取雌雄凡納濱對蝦各10尾，參照董世瑞[18]、吳立峰[19]、柴展[20]等的研究方法，利用游標(biāo)卡尺、電子天平分別對體長（Body length）、體重（Body weight）、頭甲長（Head length）、頭甲寬（Head width）、肌肉重（Muscle weight）、軀體周長、體長/體重（BL/BW）、頭甲長/頭甲重（HL/HW）、頭甲長/體長（HL/BL）和含肉率這10個性狀指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.4 PK、HK、IDH、CPT1基因表達(dá)熒光定量PCR分析

參照彭金霞[21]和Zhao[22]的試驗方法，于每試驗組隨機(jī)選取雌雄凡納濱對蝦各5尾，冰上解剖取腦、肝胰腺、肌肉組織，液氮凍存用于后繼RNA提取。按照試劑盒使用說明，使用RNAprep Pure組織樣提取試劑盒(Tiangen, DP431)提取組織混合樣總RNA，經(jīng)NanoDrop（Thermo Scientific）和凝膠電泳檢測后，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen, C28025-032）制備cDNA模版。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列信息，通過Primer Primer 6.0分別設(shè)計PK、HK、IDH與CPT1基因的引物序列。參照Shi[23]和Liu[24]的方法，使用CFX96TM熒光定量PCR儀（Bio-Rad）對組織樣中PK、HK、IDH、CPT1基因的表達(dá)情況進(jìn)行測定。PCR反應(yīng)體系（10 μL）包括5 μL SsoFastTMEvaGreen Supermix (Bio-Rad, 172-5201AP)，2微升cDNA模版，0.3 μL上下游引物和2.4 μL ddH2O。擴(kuò)增程序包括：95oC 5 min，94oC 20 s，61oC 20 s，72oC 20 s，40個循環(huán)。以-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定基因的相對表達(dá)量。內(nèi)參與PK、HK、IDH、CPT1基因引物序列如表1所示。

表1 內(nèi)參（β-actin）與PK、HK、IDH、CPT1基因引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

使用Shapiro-Wilk’s test和Levene’s test對生長性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析后，利用統(tǒng)計分析軟件“R”進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey HSD檢驗。參照劉廣緒等[25]的方法，進(jìn)行方差分析前，比例數(shù)據(jù)包括體長/體重（BL/BW）、頭甲長/頭甲重 (HL/HW)和頭甲長/體長(HL/BL)均預(yù)先進(jìn)行了反正弦轉(zhuǎn)化但在結(jié)果中以未轉(zhuǎn)化形式表述[26]。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的方式表述，采用<0.05作為統(tǒng)計檢驗的顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

參照Tallarida與Murray的方法[27]，通過Duncan檢驗分析不同生物餌料飼喂對相應(yīng)基因表達(dá)的影響。參照Young等[28]的方法，通過除以對照組相應(yīng)數(shù)據(jù)用于最終結(jié)果數(shù)據(jù)的表述。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂不同生物餌料對凡納濱對蝦生長性狀的影響

表2 飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雄性凡納濱對蝦生長性狀的影響

注：不同上標(biāo)表示兩組之間具有顯著性差異（Tukey HSD檢驗，<0.05）。

Note: Different superscripts indicate significant difference between groups (Tukey test,<0.05).

如表2所示，與對照相比飼喂生物餌料對雄性凡納濱對蝦的生長性狀指標(biāo)具有顯著影響。其中飼喂生物餌料沙蠶能顯著提高雄性凡納濱對蝦的體長、體重、頭甲長、頭甲寬、肌肉重和軀體周長。與對照組相比，飼喂烏賊組的雄性凡納濱對蝦，雖然生長性能與對照組并無顯著差別，但體型更為細(xì)長（BL/BW顯著大于對照組，<0.05），而頭部較為粗壯（HL/HW顯著小于對照組，<0.05）。各試驗組與對照組在頭體長度比和含肉率上并無顯著差別。

表3 飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雌性凡納濱對蝦生長性狀的影響

注：不同上標(biāo)表示兩組之間具有顯著性差異（Tukey HSD檢驗，<0.05）。

Note: Different superscripts indicate significant difference between groups (Tukey test,<0.05).

如表3所示，與雄性試驗獲得的結(jié)果類似，飼喂生物餌料也能顯著影響雌性凡納濱對蝦的生長性狀與體型指標(biāo)。其中飼喂生物餌料沙蠶能顯著提高雌性凡納濱對蝦的體長、頭甲長、頭甲寬和軀體周長。在各試驗組中，飼喂沙蠶的雌性凡納濱對蝦具有最大的平均體重和肌肉重，但由于組內(nèi)變異較大，與對照組相比并不顯著。此外，飼喂烏賊的雌性凡納濱對蝦，雖然生長性能與對照組并無顯著差別，但體型更為細(xì)長（BL/BW顯著大于對照組，<0.05），而頭部較為粗壯（HL/HW顯著小于對照組，<0.05）。各試驗組與對照組在頭體長度比和含肉率上并無顯著差別。

2.2 飼喂不同生物餌料對PK、HK、IDH、CPT1基因表達(dá)的影響

圖 1 飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雄性凡納濱對蝦PK（Fig 1a）、HK（Fig 1b）、IDH（Fig 1c）、CPT1（Fig 1d）基因表達(dá)的影響

**表示與對照相比具有顯著差異，下同。** indicates significant difference compared with control, the same as follows.

由圖1可見，與對照相比飼喂生物餌料對雄性凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）、異檸檬酸脫氫酶（IDH）和肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（CPT1）的表達(dá)具有顯著影響。其中，飼喂生物餌料沙蠶使上述四個代謝供能相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。與之類似，雖然己糖激酶（HK）和異檸檬酸脫氫酶（IDH）的表達(dá)并未受到顯著影響，但飼喂烏賊使得丙酮酸激酶（PK）和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶（CPT1）的表達(dá)顯著降低。上述基因的低水平表達(dá)說明此時雄性凡納濱對蝦個體糖、脂肪分解代謝活動較弱，因此與對照相比更利于能量物質(zhì)的累計，從而促進(jìn)個體生長發(fā)育。

圖 2 飼喂雙齒圍沙蠶和杜氏槍烏賊對雌性凡納濱對蝦PK（Fig 2a）、HK（Fig 2b）、IDH（Fig 2c）、CPT1（Fig 2d）基因表達(dá)的影響

如圖2所示，飼喂生物餌料對雌性凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因的表達(dá)也具有顯著性影響，但與雄性對蝦試驗結(jié)果不同。其中，飼喂生物餌料烏賊使雌性凡納濱對蝦PK、HK、IDH基因的表達(dá)顯著下調(diào)；飼喂沙蠶使HK基因表達(dá)顯著下調(diào)，而使IDH和CPT1基因的表達(dá)顯著上調(diào)。該結(jié)果表明飼喂生物餌料沙蠶、烏賊對凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因表達(dá)的影響具有明顯的性別差異。

3 討論

之前的研究表明凡納濱對蝦的生長受到諸多因素，如溫度[29]、鹽度[30]、密度[31]等的綜合影響，其中營養(yǎng)是影響凡納濱對蝦生長的關(guān)鍵因素之一[32,33]。雙齒圍沙蠶（）和杜氏槍烏賊（）是凡納濱對蝦的生物餌料之一，在養(yǎng)殖中被廣泛用于加速蝦體生長和促進(jìn)親蝦性腺發(fā)育[9,10]，然而到目前為止尚未見不同生物餌料飼喂凡納濱對蝦的效果對比研究。

相較而言，雙齒圍沙蠶粗脂肪、EPA、DHA含量顯著高于杜氏槍烏賊，而杜氏槍烏賊則具有較高的粗蛋白與膽固醇含量[9,11]。本研究獲得的結(jié)果表明，飼喂生物餌料沙蠶能顯著促進(jìn)雌、雄凡納濱對蝦的生長。該結(jié)果與之前的研究結(jié)果基本一致，劉石林等2006年的研究發(fā)現(xiàn)飼喂生物餌料沙蠶能顯著提高凡納濱對蝦的特定生長率，使得沙蠶飼喂組的終體重顯著高于配合飼料對照組[12]。飼喂沙蠶的生長促進(jìn)作用可能源于多方面原因：一方面，與配合飼料和冰鮮烏賊相比，活體沙蠶在水體內(nèi)的活動更易于誘使對蝦攝食；另一方面，沙蠶所含總必需氨基酸、鮮味氨基酸和促誘食氨基酸含量均顯著高于配合飼料，適口性高[11,12]；而且作為活體餌料，與配合飼料相比沙蠶營養(yǎng)成分組成更為合理，不存在已知的營養(yǎng)抑制因子，也更易于被消化消化吸收[9,12]。本研究還發(fā)現(xiàn)飼喂冰鮮杜氏槍烏賊的凡納濱對蝦頭部更為粗壯，由于之前的研究表明膽固醇對動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要[34]，因此可能是由于杜氏槍烏賊含有較高的膽固醇，對凡納濱對蝦頭胸甲內(nèi)神經(jīng)與消化器官的發(fā)育有促進(jìn)作用所致。

本研究發(fā)現(xiàn)飼喂生物餌料對雌、雌凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因表達(dá)的影響具有顯著的差別。對于雄性凡納濱對蝦，飼喂生物餌料使所分析的全部或部分代謝供能基因的表達(dá)顯著下調(diào)，因此機(jī)體的糖、脂肪分解代謝活動處于較低水平，利于能量物質(zhì)的累計，這可能也是其具有生長促進(jìn)作用的內(nèi)在原因之一。而對于雌性凡納濱對蝦，飼喂生物餌料對所分析的代謝供能基因表達(dá)的影響則較為復(fù)雜。其中飼喂雙齒圍沙蠶使雌性凡納濱對蝦HK基因的表達(dá)顯著下調(diào)，使IDH和CPT1基因的表達(dá)顯著上調(diào)。由于雌、雄凡納濱對蝦在攝食、游動等行為上可能存在差異[35]，因此IDH和CPT1基因表達(dá)的上調(diào)可能是為雌性凡納濱對蝦活躍的游泳與搶食提供必要的能量供給所致。同理，由于飼喂的杜氏槍烏賊為冰鮮個體，誘食效果顯著弱于活體沙蠶，因此飼喂冰鮮烏賊并未使IDH等代謝供能基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著的上調(diào)。雌、雄凡納濱對蝦在代謝供能基因表達(dá)上的顯著差異，很可能是由于其在發(fā)育、營養(yǎng)需求等方面的不同所致[36-38]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，飼喂生物餌料對雌、雄凡納濱對蝦的生長具有顯著的影響，其中飼喂雙齒圍沙蠶對凡納濱對蝦具有顯著的生長促進(jìn)作用。同時飼喂生物餌料雙齒圍沙蠶、杜氏槍烏賊能對雌、雌凡納濱對蝦代謝供能關(guān)鍵基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，并且具有性別差異。這一結(jié)果表明雌、雄性凡納濱對蝦在營養(yǎng)需求、代謝生長上可能存在顯著的性別差異。

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Impacts Feedingandon the Growth Performance and Energy Supply Genes Expression of

HUANG Xian-ke1, ZHA Shan-jie2, LIU Guang-xu2, ZHANG Min1, XIAO Guo-qiang1, YAN Mao-cang1, HU Li-hua1*

1.325005,2.310058,

In the present study,feeding experiment andqPCR were conducted to investigate the impacts of two natural feed (and) on the growth performance and expression of metabolic genes of Pacific white shrimp (). According to the ten growth performance traits measured,was shown to be a growth-inducing feed. When fed with, the body length, body weight, head length, head width, muscle weight, body circumference of male individuals and the body length, head length, head width, body circumference of female ones were all significantly greater than those of the control. Although the growth performance of Pacific white shrimp fed onwas not significant different from that of the control, more slender body shape (BL/BW significantly greater than the control group,<0.05) and more stubbed head (HL/HW significantly lower than control group,<0.05) were detected in the Pacific white shrimp fed on. Moreover, different feeds exerted significant impacts on the expression of PK, HK, IDH, and CPT1 genes of both male and female individuals. Significant differences in term of gene expression alteration were also detected between male and female individuals when fed with the natural feeds investigated.

Natural feed; white shrimp; growth performance; gene expression

S963.2

A

1000-2324(2019)01-0112-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.025

2017-08-31

2017-10-17

浙江省農(nóng)業(yè)（水產(chǎn)）新品種選育重大科技專項(2016C2055-5);浙江省科技計劃項目(2017F30043);溫州市科技計劃項目(N20140015);溫州市科技計劃項目(N20150040)

黃賢克(1981-),男,研究生,工程師,主要從事海水增養(yǎng)殖方面的工作. E-mail:hxkdu@163.com

Author for correspondence.. E-mail:hulihua1208@163.com