陳姍姍,艾聰聰,盛慧,孫柏華,馮銳,王中洋,黃愷浩,王曉梅*

辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781與其互作蛋白的酵母互作一對一驗(yàn)證

陳姍姍1,艾聰聰2,盛慧2,孫柏華2,馮銳2,王中洋2,黃愷浩2,王曉梅1*

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 長春 130118 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院;山東省蔬菜病蟲生物學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）引起的辣椒疫病是毀滅性土傳病害，短期內(nèi)暴發(fā)成災(zāi)，該病害嚴(yán)重發(fā)生常給辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。植物病原卵菌分泌大量的胞內(nèi)效應(yīng)分子，即RxLR效應(yīng)分子，能干擾寄主植物細(xì)胞的正常生理代謝和功能，在病原卵菌侵染寄主及與寄主植物互作過程發(fā)揮著重要的作用。酵母雙雜交（Yeast two hybrid, Y2H）系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)相互作用最常用的方法，它既可以在cDNA文庫中篩選互作的未知靶標(biāo)蛋白，同時還可以驗(yàn)證兩個目的蛋白之間的互作關(guān)系。本研究分別以辣椒疫霉cDNA基因組，辣椒cDNA基因組為模板，克隆了辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR19781以及其疑似互作蛋白泛素連接酶E2 10和辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白EARLI 1，并將它們分別成功構(gòu)建到PGBKT7和PGADT7載體上。運(yùn)用酵母共轉(zhuǎn)化技術(shù)，將帶有AD載體的互作蛋白和帶有BD載體的效應(yīng)因子共同轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)Y2HGold中，對它們是否存在互作關(guān)系進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明，兩個疑似互作蛋白都與效應(yīng)因子RxLR19781互作。但由于酵母雙雜交存在一定的假陽性，因此該效應(yīng)分子與互作蛋白的互作有待進(jìn)一步深入的研究。

辣椒疫霉菌; RXLR效應(yīng)分子; 酵母雙雜交

辣椒疫霉菌()引起的辣椒疫病是在世界范圍內(nèi)廣泛分布的毀滅性病害之一[1]，其寄主范圍廣，引起的作物疫病是作物生產(chǎn)上的災(zāi)難病害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，因此具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)與生態(tài)學(xué)的意義[3]。疫霉菌分泌大量的效應(yīng)分子，一類為胞間效應(yīng)分子，一類為胞內(nèi)效應(yīng)分子[4]其中RxLR效應(yīng)分子是一類胞內(nèi)效應(yīng)分子嗎，其能干擾寄主植物細(xì)胞的正常生理代謝和功能。RxLR效應(yīng)分子分為兩個功能區(qū)：N端區(qū)包括信號肽和RxLR-dEER，其中約為20個氨基酸長短的信號肽可引導(dǎo)效應(yīng)蛋白進(jìn)入真核細(xì)胞[5]，RxLR和相關(guān)的dEER（Asp-Glu-Glu-Arg；前導(dǎo)Asp可變）基因以某種方式穿過宿主質(zhì)膜將病原效應(yīng)蛋白傳送至宿主細(xì)胞[6,7]。C端區(qū)是效應(yīng)因子功能域，將效應(yīng)蛋白定位于胞內(nèi)靶標(biāo)位點(diǎn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[8]。通常有W、Y、L、K保守域，其中W域主要與抑制植物細(xì)胞死亡有關(guān)[9]?；蚪M測序表明辣椒疫霉含350個候選RxLR效應(yīng)分子[5]，而且這些效應(yīng)分子與寄主的互作符合基因?qū)蚣僬f[10]，利用辣椒的抗病基因是防控辣椒疫病最有效的措施。因此研究辣椒疫霉效應(yīng)因子與寄主靶標(biāo)蛋白分子水平的互作機(jī)制是揭示其致病機(jī)理及寄主抗病機(jī)理的重要途徑。

酵母雙雜系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system, Y2H)是一種利用單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)[11]，是研究蛋白質(zhì)相互作用最常用的方法[12]。真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，轉(zhuǎn)錄激活因子通常有兩個或兩個以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(Activation domain, AD)。通常融合在含有BD結(jié)構(gòu)域載體上的基因稱為“誘餌蛋白”，融合在含有AD結(jié)構(gòu)域的基因稱為“獵物蛋白”，如果兩個蛋白能夠直接相互作用，會使兩個結(jié)構(gòu)域在空間位置上相互靠近，形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活酵母細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)報告基因，使報告基因表達(dá)；反之，如果兩個蛋白沒有發(fā)生直接的相互作用，報告基因的則不會被激活轉(zhuǎn)錄[13]。通過將攜帶誘餌蛋白的BD載體和攜帶獵物蛋白的AD載體共同轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold菌株中，然后利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，檢測Y2HGold菌株中4個報告基因（AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1）的表達(dá)來分析蛋白之間的相互作用。

雖然酵母雙雜交技術(shù)具有篩選效率高、可直接在核酸水平操作、接近植物細(xì)胞條件所編碼的外源蛋白能夠保持正確折疊方式等優(yōu)點(diǎn)，但依然存在其局限性：酵母雙雜是基于轉(zhuǎn)錄的體系，能自發(fā)激活報告基因的誘餌蛋白不適合做篩選；酵母雙雜篩選分離不到經(jīng)過翻譯后修飾才具有蛋白質(zhì)結(jié)合活性的蛋白質(zhì)；如果相互作用有其他非肽類成分的參與，則蛋白質(zhì)之間的相互作用就無法檢測到；相互作用可能缺少生物學(xué)上的微環(huán)境，很多蛋白質(zhì)相互作用只發(fā)生在特定的生理環(huán)境下。因此蛋白質(zhì)間的相互作用還需其他方法加以驗(yàn)證提高其可靠性。

本研究運(yùn)用酵母共轉(zhuǎn)化技術(shù)，對辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR19781以及其疑似互作蛋白泛素連接酶和辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白是否存在互作關(guān)系進(jìn)行了深入研究。之前得到研究表明效應(yīng)因子RxLR19781在植物抗病途徑中發(fā)揮重要作用，因此具有研究價值。本研究結(jié)果表明，兩個疑似互作蛋白都與效應(yīng)因子RxLR19781互作。此研究為后續(xù)驗(yàn)證互作提供了理論可能性，為揭示辣椒疫霉抗病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

辣椒疫霉菌株SD33由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，辣椒為本實(shí)驗(yàn)室種植的自交系06221, YPDA、SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-gal、AbA、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、鮭魚精DNA均購自Clontech公司。

1.2 載體與感受態(tài)

本研究所用載體包括：PGADT7，PGBKT7購自Clontech公司。感受態(tài)細(xì)胞酵母Y2HGold感受態(tài)自制。

1.3 辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781及其疑似互作蛋白的克隆與載體構(gòu)建

以辣椒疫霉SD33基因組DNA為模板，根據(jù)載體圖譜選擇雙酶切位點(diǎn)，效應(yīng)因子RxLR191的酶切位點(diǎn)分別選擇NdeI和Cla I，根據(jù)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，克隆帶有酶切位點(diǎn)的RxLR19781片段，設(shè)計(jì)引物如下F：CATATGCTGTCGACACAAGCTGACGC，R：‐ATCGATAGGAAGTCCTTTCTTGTTAA。反應(yīng)體系5.0μL10×PCR buffer (Mg2+plus)，4.0μLdNTP，1.0μLForward Primer (10μmol/L)，1.0μLReverse Primer (10μmol/L)，2.0μLDNA，0.5μLTaq聚合酶，36.5μL dd H2O，共50μL體系；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2~5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸20 s，共反應(yīng)30個循環(huán)，72℃總延伸5min，PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，回收目的條帶，膠回收步驟按照Bio Teke Corporation多功能DNA純化回收試劑盒中說明書操作。將回收產(chǎn)物與載體質(zhì)粒分別用Nde I和Cla I進(jìn)行雙酶切，37℃酶切2h。酶切體系為：dd H2O 24μL，10×buffer 2μL, DNA 10μL，Kpn I內(nèi)切酶2μL，Bam H I內(nèi)切酶2μL?；厥彰盖挟a(chǎn)物，連接目的基因與載體，16℃4~6h，連接體系為：載體8μL，目的基因2μL，Solution I10μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，用Kana進(jìn)行抗性篩選并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測序正確后提取質(zhì)粒。

同理，以辣椒基因組為模板，克隆并構(gòu)建疑似互作蛋白泛素連接酶和辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的載體。設(shè)計(jì)泛素連接酶引物如下：F：CGGAATTCATGGCGAAGCCAATTG，R：CGGGATCCTTACTTCATCTTTTTCCGGACTTC。設(shè)計(jì)辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白引物如下：F：CGGGATCCATGGCTTCCAAGAAAACTAC，R：CCCTCGAGATTAGGACATTGAAAGCCAG。再根據(jù)構(gòu)建效應(yīng)分子載體的步驟，直到測序正確提取質(zhì)粒。

1.4 酵母感受態(tài)的制備

將Y2HGold酵母菌株在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線活化，30℃培養(yǎng)2~3 d，挑取2~3mm大小的單菌落到3 mL YPDA液體培養(yǎng)基中（Kana），30℃，250rpm過夜搖菌至菌液渾濁；向50mL YPDA（Kana）液體培養(yǎng)基中加入5μL過夜培養(yǎng)的酵母菌液，30℃，250rpm搖到OD600值在0.15~0.3左右；3500 rpm離心5 min，棄上清，再用100mL YPDA（Kana）培養(yǎng)基重懸菌體，并繼續(xù)30℃，250rpm搖菌培養(yǎng)至OD600=0.5左右；25℃，3500rpm離心5min，倒掉上清，用20mL滅菌后的超純水重懸菌體并離心3500rpm，5min；棄上清，用1.5mL的1.1×TE/LiAc重懸菌體，分裝到兩個1.5mL的PE離心管中，14000rpm，離心15 s，棄上清液；向每個離心管中加600μL的1.1×TE/LiAc重懸，感受態(tài)即制好。

1.5 酵母共轉(zhuǎn)化互作驗(yàn)證

將誘餌載體BD（RxLR19781BD）與獵物載體AD用共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入到酵母菌株Y2HGold中，具體步驟如下，（1）加入構(gòu)建好的重組BD質(zhì)粒g與AD質(zhì)粒100ng~500ng，加入5μL的變性鮭魚精（10mg/mL），加入50~70μL感受態(tài)細(xì)胞，輕彈混勻，加入PEG/LiAc 500μL，輕彈混勻；（2）放到30℃水浴孵育30min，每10min輕輕顛倒混勻1次；（3）30℃孵育結(jié)束后加入20μL的DMSO，用移液器輕輕吸打混勻；（4）42℃水浴15min，每5min溫和顛倒混勻1次；（5）高速離心15 s，通常選擇140000 rpm，離心15 s，用移液器吸盡上清液，慢慢吸走，避免將沉淀的菌液重懸起來；（6）加入1 mL的YPD Plus，重懸菌體，30 ℃，250 rpm，震蕩孵育45~60 min；（7）高速離心140000 rpm，15 s，移液器吸盡上清液，避免吸起沉淀的菌體；（8）用0.9%的NaCl重懸菌體，取適量的重懸液涂布在SD/-Trp/-Leu，SD/-Trp/-Leu /-His和SD/-Ade/-His /-Trp/-Leu平板上，30 ℃，倒置培養(yǎng)3~4 d。在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上長出單菌落之后，挑取單菌落分別點(diǎn)斑于SD/-His /-Trp/-Leu和SD/-Ade /-His/ -Trp/-Leu /+ X-a-gal固體培養(yǎng)基上，30 ℃暗培養(yǎng)7~10 d，記錄觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR19781的克隆及載體的構(gòu)建

以辣椒疫霉cDNA為模板，以RxLR19781-BD-F、RxLR19781-BD-R為引物，擴(kuò)增片段，成功構(gòu)建RxLR19781-BD誘餌載體。

2.2 辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR19781的疑似互作蛋白泛素連接酶E2 10的克隆及載體的構(gòu)建

以辣椒cDNA為模板，以E2-10-AD-F，E2-10-AD-R為引物，克隆疑似互作蛋白泛素連接酶E2 10全長序列，并成功構(gòu)建至PGADT7獵物載體。

圖 1 RxLR19781基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖 2 E2-10疑似互作蛋白PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR19781的疑似互作蛋白辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白EARLI 1的克隆及載體的構(gòu)建

以辣椒cDNA為模板，以EARLI 1-AD-F，EARLI 1-AD-R為引物，克隆疑似互作蛋白辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白EARLI 1全長序列，并成功構(gòu)建至PGADT7獵物載體。

圖 3 EARLI 1疑似互作蛋白PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 RxLR19781與互作蛋白泛素連接酶E2 10全長共轉(zhuǎn)化互作驗(yàn)證

將RxLR19781-BD與E2 10-AD共同轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold驗(yàn)證互作關(guān)系。RxLR19781-BD與E2 10-AD共轉(zhuǎn)化后均在加入X-a-gal的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu平板上變藍(lán)，表明E2 10與RxLR19781存在互作關(guān)系。

圖 4 Y2H驗(yàn)證RxLR19781與E2 10互作

2.5 RxLR19781與互作蛋白辣椒脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白EARLI 1全長共轉(zhuǎn)化互作驗(yàn)證

將RxLR19781-BD與EARLI 1-AD共同轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2HGold驗(yàn)證互作關(guān)系。RxLR19781-BD與EARLI 1-AD共轉(zhuǎn)化后均在加入X-a-gal的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu平板上變藍(lán)，表明EARLI 1與RxLR19781存在互作關(guān)系。

圖 5 Y2H驗(yàn)證RxLR19781與EARLI 1互作

3 結(jié) 論

本研究將酵母雙雜交初步篩選出的疑似互作蛋白E210和EARLI 1，經(jīng)過酵母雙雜交一對一驗(yàn)證，初步驗(yàn)證了它們與效應(yīng)因子RxLR19781存在互作關(guān)系。目前已知效應(yīng)分子RxLR19781能夠在植物抗病途徑中起作用，但具體是如何與互作蛋白協(xié)同發(fā)揮作用還未知，且酵母雙雜交存在一定的假陽性，因此通過酵母雙雜交一對一驗(yàn)證得到的互作蛋白，為后期的CO-IP、Poll-Down實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)前提，為揭示辣椒疫霉效應(yīng)因子的抗病機(jī)理提供了理論依據(jù)，同時也為防治辣椒疫霉做出理論基礎(chǔ)貢獻(xiàn)。

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One-to-one Verification of the Interaction between theEffector Molecule RxLR19781 and Its Interacting Protein

CHEN Shan-shan1, AI Cong-cong2, SHENG Hui2, SUN Bai-hua2, FENG Rui2, WANG Zhong-yang2, HUANG Kai-hao2, WANG Xiao-mei1*

1.130118,2.271018,

Capsicum blight caused byis a devastating soil-borne disease, which is a disaster in a short period of time. The serious occurrence of this disease often causes serious losses to pepper production. Plant pathogenic oocysts secrete a large number of intracellular effector molecules, namely RxLR effector molecules, which can interfere with the normal physiological metabolism and function of host plant cells, and play an important role in the process of infecting host and host plants with pathogenic oomycetes. The yeast two-hybrid (Y2H) system is the most commonly used method for studying protein interactions. It can not only screen for unknown target proteins in cDNA libraries; but also verify the interaction between two proteins of interest. The Phytophthora cDNA genome and the capsicum cDNA genome were used as templates to clone theeffect factor RxLR19781 and its suspected interacting protein ubiquitin ligase E210 and capsicum lipid transfer protein EARLI 1. They were successfully constructed on the PGBKT7 and PGADT7 vectors, respectively. Using yeast co-transformation technology, the interaction protein with AD vector and the effector factor with BD vector were transformed into yeast competent Y2HGold, and their interaction relationship was studied. The results showed that both suspected interaction proteins interacted with the effector RxLR19781. However, due to the existence of certain false positives in yeast two-hybrid, the interaction between the effector molecule and the interacting protein is required to further study out。

; RXLR effector; yeast two-hybrid

S436.418.1+2

A

1000-2324(2019)01-0044-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.009

2018-05-12

2018-06-21

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

陳姍姍(1994-),女,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原卵菌分子遺傳學(xué). E-mail:572120560@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wxm820@126.com