劉小縵,王群,王石,高素素,王曉梅*

?

分裂泛素化酵母雙雜交系統(tǒng)研究信息素因子STE2蛋白相互作用

劉小縵1,王群2,王石2,高素素2,王曉梅1*

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 長(zhǎng)春 130118 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院;山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 泰安 271018

真菌的進(jìn)化、分化及有性發(fā)育趨勢(shì)受若干性別基因的調(diào)控，如交配型、信息素因子及異源三聚體G-蛋白-亞基基因等；同時(shí)，信息素因子調(diào)控真菌的有性生殖在釀酒酵母中也得到充分研究。匍柄霉屬()是絲狀子囊真菌中的一類重要真菌類群，許多絲狀子囊真菌屬、種中含有信息素因子。在自然界中，匍柄霉屬真菌大多數(shù)是以無(wú)性態(tài)的形式存在，但其中也有一小部分存在有性生殖階段。為了深入研究信息素受體STE2及其相關(guān)基因?qū)楸箤俚湫头N有性生殖的影響，本研究選取含有信息素因子STE2的匍柄霉屬典型種為試驗(yàn)材料，克隆鑒定了信息素受體STE2，然后將其構(gòu)建至誘餌蛋白表達(dá)載體上，并在cDNA文庫(kù)初篩得到數(shù)個(gè)疑似互作蛋白片段基礎(chǔ)上，克隆其基因全長(zhǎng)構(gòu)建至靶蛋白表達(dá)載體上，并利用分裂泛素化的膜酵母雙雜交系統(tǒng)，進(jìn)行一對(duì)一驗(yàn)證篩選STE2的相關(guān)互作蛋白。該研究篩選出的互作蛋白結(jié)果為后期的CO-IP、Poll-Down實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

信息素因子STE2; 匍柄霉屬; 分裂泛素酵母雙雜交; 互作蛋白

真菌的有性發(fā)育、分化及進(jìn)化趨勢(shì)受若干性別基因的調(diào)控，主要包括異源三聚體G-蛋白-亞基基因、交配型基因（MAT）（MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因）、信息素因子（信息素前體基因和信息素受體基因），它們?cè)谡婢行苑只鞍l(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用，而且相互協(xié)同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的性別調(diào)控系統(tǒng)[1]。匍柄霉屬（）為格孢腔菌（Pleospora）類群，由Wallroth于1833年以匍柄霉 (Wall.)為模式種建立的一種重要真菌屬[2]。在生物界中大部分絲孢真菌屬、種主要以無(wú)性型存在，而新西蘭匍柄霉()是在實(shí)驗(yàn)室條件下能產(chǎn)生有性態(tài)的少數(shù)菌種之一，該種含有交配型基因和，是同宗配合真菌[3]。

絲狀子囊真菌含有信息素前體基因和信息素受體基因(Pheromones and pheromone receptors)，該類基因分別包括兩個(gè)信息素前體基因（a和）和兩個(gè)信息素受體基因（ste2和ste3），其中信息素受體基因（ste2和ste3）對(duì)性細(xì)胞識(shí)別、交配及交配后活動(dòng)具有關(guān)鍵調(diào)控作用，可激活真菌異型細(xì)胞的有性生殖過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)加工的信息素因子被a細(xì)胞表面的STE2受體識(shí)別，激活交配信號(hào)，啟動(dòng)MAPK途徑，引發(fā)交配過(guò)程[4]；同樣，經(jīng)過(guò)加工的信息素a因子被細(xì)胞表面的STE3受體識(shí)別[5]，執(zhí)行同樣功能。所以，信息素及其受體對(duì)匍柄霉屬等真菌有性生殖有重要的影響。

蛋白質(zhì)間相互作用的研究作為了解蛋白質(zhì)生物功能的重要手段之一，在功能基因組學(xué)研究中起著重要的作用[6]。Fields等[7]發(fā)展的酵母雙雜交系統(tǒng)已被廣泛用于體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的[8,9]但傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)要求所檢測(cè)的生物分子必須同時(shí)定位在親水性的核基質(zhì)中并具有功能結(jié)構(gòu)，對(duì)于發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)間的相互作用將無(wú)法檢測(cè)[10]。為此，Stagljar等[11]在2002年發(fā)展了基于分裂泛素的膜酵母雙雜交系統(tǒng)。

膜酵母雙雜交系統(tǒng)基于分裂的泛素蛋白的重組，泛素是一類標(biāo)記其他蛋白降解的小而高度保守的蛋白。泛素分子為76個(gè)氨基酸的肽鏈,并具有位于N端(Nub)及C端(Cub)的兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域[12]，如果這兩部分在細(xì)胞中分開(kāi)表達(dá)則他們都是部分折疊因此不能被泛素特異性蛋白酶(USPS)識(shí)別，如果Nub和Cub在同一細(xì)胞中共表達(dá)，兩個(gè)部分依靠彼此之間強(qiáng)烈的親和性，可以形成完整的泛素蛋白從而被USPS迅速識(shí)別并切割。分裂的野生型Nub(Nubl)和cub能通過(guò)擴(kuò)散一碰撞模式重新自發(fā)折疊成具有生物活性的結(jié)構(gòu)[12]。NubI突變?yōu)镹ubG后，分裂的NubG和Cub沒(méi)有親和力不能再以擴(kuò)散一碰撞的模式重新折疊，因此可以利用這個(gè)特性將bait蛋白融合到泛素的Cub末端，并在Cub的N端或C端連接一個(gè)人工轉(zhuǎn)錄因子PLv(por一LeAx一VP16)，prey蛋白融合到泛素的N末端上；bait蛋白和prey相互作用時(shí)，使得兩者相互接近被融合的NubG和Cub重新折疊成完整泛素蛋白[11]被USPS識(shí)別切割，而釋放轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核上從而激活報(bào)告基因Hsi3和LacZ的表達(dá)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

分裂泛素化酵母雙雜交系統(tǒng)所用的誘餌蛋白載體PCCW-STE、靶蛋白載體pDSL-Nx、對(duì)照靶載體pAI-Alg5以及營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母菌株NMY51由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李一博老師惠贈(zèng)。DH5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶sfi Ⅰ購(gòu)自Thermo science公司。YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、3AT、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、鮭魚(yú)精DNA購(gòu)自clontech。

1.2 方 法

1.2.1 STE2-PCCW-STE誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建以匍柄霉基因組DNA為模板，利用帶有sfiⅠ識(shí)別位點(diǎn)的特異性引物，PCR擴(kuò)增帶有特異性序列的STE2片段。設(shè)計(jì)特異引物如下：

F：5′-GTAATGGCCATTACGGCCATGGAGGCCGAACCAATC‐3′，

R：5′-GATGGCCGAGGCGGCCTTCTGTTCATGCTCTTGTGC‐3′

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，回收目的條帶，將回收產(chǎn)物用Sfi I酶切，分離酶切得到的目的片段和Sfi I酶切的PCCW-STE載體片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)中，用Kana進(jìn)行抗性篩選并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒得到STE2-PCCW-STE載體。

1.2.2 構(gòu)建完整靶蛋白基因的pDSL-Nx載體把用cDNA文庫(kù)初篩得到數(shù)個(gè)疑似互作蛋白片段與NCBI比對(duì)，得到的編號(hào)為01239、05727的全長(zhǎng)核苷酸序列，并以匍柄霉基因組DNA為模板，利用帶有sfiⅠ識(shí)別位點(diǎn)的特異性引物PCR擴(kuò)增得到01239、05727基因的全長(zhǎng)核苷酸序列，將靶蛋白基因全長(zhǎng)構(gòu)建到pDSL-Nx載體上。用Amp進(jìn)行抗性篩選并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測(cè)序正確后提取質(zhì)粒得到01239-pDSL-Nx及05727-pDSL-Nx載體。

特異引物如下：

01239-pDSL-Nx-F：5’-CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCATGGCCCTTGCTGGCCTCT-3’

01239-pDSL-Nx-R：5’-CGAATTCTCGAGAGGCCGAGGCGGCCGTTAGACAGAAGCGTACGCCT-3’

05727-pDSL-Nx-F：5’-CAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCATGGACGGAA AGGATAGCG-3’

05727-pDSL-Nx-R：5’-CGAATTCTCGAGAGGCCGAGGCGGCCGCTACGCCGGG GCAGGT-3’

1.2.3 PEG/LiAc法共轉(zhuǎn)酵母菌株NMY51用接種環(huán)挑取保存的適量NMY51酵母菌株，在2*YPDA固體培養(yǎng)基上劃線活化酵母，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3~4 d；待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出酵母菌落，挑取單個(gè)菌落于1 mL 2*YPDA液體培養(yǎng)基中重懸，并全部接種到含有50 mL 2*YPDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中在30 ℃，250 rpm條件下的搖床中培養(yǎng)14~16 h，至OD600值為0.6~0.8；用1 mL離心管（只數(shù)大于所需轉(zhuǎn)化數(shù)）分裝后于12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄凈上清；然后用1 mL滅菌水重懸洗滌菌體，12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄上清；加入10 mg/mL的變性鮭魚(yú)精DNA，再分別加入500 ng共轉(zhuǎn)質(zhì)粒（質(zhì)粒組合：STE2-PCCW-STE/01239-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/05727-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/pDSL-Nx、PCCW-STE/01239-pDSL-Nx、PCCW-STE/05727-pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/PAI-ALG5）并用渦旋儀快速渦旋混勻；加入120 μL、50%的PEG 3350和17 μL的10×LiAc，用渦旋儀渦旋1 min后于42 ℃水浴鍋熱擊1 h（其間再渦旋1次），之后12000 rpm、30 s離心收集菌體，棄凈上清；用400 μL ddH2O重懸沉淀涂布在SD/-Leu/-Trp營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3~4 d。

1.2.4 誘餌蛋白、靶蛋白的自激活鑒定在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落之后，分別挑取質(zhì)粒組合為STE2-PCCW-STE/pDSL-Nx、STE2-PCCW-STE/01239（05727）-pDSL-Nx和PCCW-STE/01239（05727）-pDSL-Nx的單菌落分別點(diǎn)斑于含0、10、20、30、40、50、60、70、80和100 mmol L?13-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)的三缺培養(yǎng)基(SD/-His/-Leu/-Trp)和四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上，30 ℃培養(yǎng)3~4 d后觀察。

1.2.5 酵母雙雜交鑒定篩選誘餌蛋白、靶蛋白的自激活后，挑取單菌落分別點(diǎn)斑于SD/-His/-Leu/-Trp+3-AT、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp /+ X-β-gal+3-AT固體培養(yǎng)基上，30 ℃暗培養(yǎng)4~6 d，記錄觀察結(jié)果。

由于靶蛋白載體pDSL-Nx上有編碼Trp的基因，誘餌蛋白載體PCCW-STE上有編碼Leu的基因，因此如果共轉(zhuǎn)化酵母成功，酵母能夠在營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/-Leu/-Trp固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，用來(lái)檢驗(yàn)共轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)化效率，而SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基用來(lái)驗(yàn)證與STE2互作的蛋白，如果某個(gè)基因表達(dá)的蛋白能夠與STE2發(fā)生互作，則與其分別融合的Cub和NubG就會(huì)相互靠近而重新組成完整的泛素蛋白，進(jìn)而被UBPs識(shí)別，釋放轉(zhuǎn)錄因子VP16到細(xì)胞核中，啟動(dòng)報(bào)告基因Ade2、His3，因而可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；同時(shí)LacZ基因編碼β半乳糖苷酶，可以進(jìn)行β半乳糖苷酶活性檢驗(yàn)，陽(yáng)性酵母克隆會(huì)表現(xiàn)為藍(lán)色，初步確定蛋白的互作。

2 結(jié)果與分析

2.1 信息素因子STE2的基因克隆及誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建

信息素受體STE2為7次跨膜蛋白，3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)和3個(gè)細(xì)胞外環(huán)連接7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，整個(gè)蛋白質(zhì)N端在細(xì)胞外，C端在細(xì)胞內(nèi)。信息素因子STE2序列全長(zhǎng)為1110 bp，編碼369個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量42.33 kDa。克隆目的條帶在1000 bp略偏上處（圖1）。該基因用于構(gòu)建融合載體STE2-PCCW-STE，并經(jīng)PCR驗(yàn)證。

圖 1 STE2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 靶蛋白基因的克隆及pDSL-Nx載體構(gòu)建

經(jīng)NCBI網(wǎng)站中的blastn工具進(jìn)行序列比對(duì)，選用匍柄霉基因組與篩選疑似序列核苷酸片段同源性最高的基因比對(duì)，得到的編號(hào)為01239（糖苷水解酶128蛋白）的序列全長(zhǎng)為795 bp，編碼264個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量28.94 kDa；05727（多元運(yùn)輸?shù)鞍?）的序列全長(zhǎng)為1893 bp，編碼630個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量69.81 kDa。其中01239克隆目的條帶在750 bp~1000 bp處（圖2-A），該基因用于構(gòu)建融合載體01239-pDSL-Nx，并經(jīng)PCR驗(yàn)證；05727克隆目的條帶在接近2000 bp處（圖2-B），該基因用于構(gòu)建融合載體05727-pDSL-Nx，并經(jīng)PCR驗(yàn)證。

圖 2 疑似互作蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

A：01239；B：05727

2.3 誘餌蛋白、靶蛋白的自激活鑒定

由于STE2-PCCW-STE2質(zhì)粒不能和pDSL-Nx載體上的NubG重建，轉(zhuǎn)錄因子不被切離，不能激活酵母菌中的啟動(dòng)子，因此二者共轉(zhuǎn)化的酵母菌不應(yīng)該在三缺、四缺板上生長(zhǎng)。但是His有一定程度的本底表達(dá)，因此需要用3-AT來(lái)抑制His的本底表達(dá)。在添加不同濃度3-AT的三缺培養(yǎng)基(SD/-His/-Leu/-Trp)和四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上點(diǎn)斑培養(yǎng)來(lái)鑒定自激活活性。結(jié)果表明，誘餌蛋白存在自激活現(xiàn)象，只有在含50 mmol L-13-AT的三缺培養(yǎng)基上His本底表達(dá)被完全抑制，不能正常生長(zhǎng)(圖3-A)；在含30 mmol·L-13-AT的四缺培養(yǎng)基上自激活被完全抑制，不能正常生長(zhǎng)(圖3-B)，而陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒能正常生長(zhǎng)；同樣，01239與05727也存在自激活現(xiàn)象，只有在含70 mmol·L-13-AT的三缺培養(yǎng)基上、50 mmol·L-13-AT的四缺培養(yǎng)基上自激活被完全抑制，不能正常生長(zhǎng)(圖3)。

圖 3 誘餌蛋白和靶蛋白自激活特性檢測(cè)及抑制His本底表達(dá)的3-AT濃度篩選

A：在三缺培養(yǎng)基(SD/-His/-Leu/-Trp)上點(diǎn)斑篩選培養(yǎng) B：在四缺培養(yǎng)基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp）上點(diǎn)斑篩選培養(yǎng)

A: Spot culture of yeast NMY51 transformant on the SD/-His/-Leu/-Trp medium B: Spot culture of yeast NMY51 transformant on the SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp medium

2.4 酵母雙雜交初步鑒定

暗培養(yǎng)4~6 d后觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化有空誘餌蛋白載體或空prey載體的不同質(zhì)粒組合的陰性對(duì)照的酵母在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)基因號(hào)01239、05727及陽(yáng)性對(duì)照可以在及SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+3-AT培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，經(jīng)-半乳糖苷酶活性進(jìn)一步驗(yàn)證，參照陽(yáng)性對(duì)照發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化01239、05727靶蛋的酵母菌落明顯變?yōu)樗{(lán)色，有較強(qiáng)地-半乳糖苷酶活性，而陰性對(duì)照不顯藍(lán)色(圖4)。初步確定01239和05727為與STE2互作的蛋白，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

圖 4 互作蛋白的驗(yàn)證及β-半乳糖苷酶活性驗(yàn)證

3 討論

本研究?jī)?nèi)容是通過(guò)膜系統(tǒng)酵母雙雜交方法，對(duì)信息素因子STE2的互作蛋白進(jìn)行一對(duì)一驗(yàn)證，得到了步驗(yàn)證的與STE2互作的2個(gè)蛋白，一個(gè)是糖苷水解酶家族蛋白01239，另一個(gè)多元運(yùn)輸類蛋白05727。目前，已有許多性別基因控制真菌有性生殖過(guò)程的研究，如在釀酒酵母中STE2、G蛋白等調(diào)控有性交配的過(guò)程。但是有關(guān)匍柄霉有性生殖的研究，特別是信息素及相關(guān)基因調(diào)控MAPK通路的研究少之又少。本研究初步驗(yàn)證了STE2和01239、05727在酵母中的互作，但是它們二者間的互作在真菌中發(fā)揮的生理作用尚不清楚，這為深入研究信息素受體的功能提供了基礎(chǔ)以及為后期的CO-IP、Poll-Down實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)前提。

[1] 王群,王石,劉小縵,等.絲孢真菌無(wú)性與有性進(jìn)化分析[J].菌物研究,2017,15(4):213-221

[2] Wallroth FG. Flora[J]. Google Scholar, 1833,2:182-184

[3] Inderbitzin P, Mehta YR, Berbee ML. Pleospora species withanamorphs: a four locus phylogeny resolves new lineages yet does not distinguish among species in theclade[J]. Mycologia, 2009,101(3):329-339

[4] Jenness DD, Burholder AC, Hartwell LH. Binding of K-factor pheromone to yeast a cells: Chemical and genetic evidence for an K-factor receptor[J]. Cell, 1983,35(2 Pt 1):521-529

[5] Nakayama N, Miyajima A, Arai K. Nucleotide sequences of STE2 and STE3, cell type-specic sterile genes from[J]. The EMBO Journal, 1985,4(10):2643-2648

[6] 武明花,李桂源.分離的泛素系統(tǒng)----—種新型的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊(cè),2005,28(2):88-90

[7] Fields S, Song OK. A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J]. Nature, 1989,40(18):245-246

[8] Coates PJ, Hall PA. The yeast two-hybrid system for identifying protein-protein interactions[J]. J Pathol, 2003,199(l):4-7

[9] Brachmann RK, Boeke JD. Tag games in yeast: the two-hybrid system and beyond[J]. Curr Opin Biotechnol, 1997,8(5):561-568

[10] Reinders A, Schulze W, Thaminy S,. Intra- and intermolecular interactions in sucrose transporters at the plasma membrane detected by the split-ubiquitin system and functional assays[J]. Structure, 2002,10(6):763-772

[11] Stagljar I, Korostensky C, Johnsson N,. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(9):5187-5192

[12] Johnsson N, Varshavsky A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo[J]. Proc. Nati. Acad. Sci., 1994,91:10340-10344

[13] 藺芳芳,楊旭,武小翠,等.利用分裂泛素酵母雙雜交技術(shù)釣取小麥TaSC互作蛋白質(zhì)[J].作物學(xué)報(bào),2013,39(3):423-430

Pheromone Factor STE2 Protein Interaction Split Studied by Ubiquitinated Yeast Two-hybrid System

LIU Xiao-man1, WANG Qun2, WANG Shi2, GAO Su-su2, WANG Xiao-me1*

1.130118,2.271018,

The evolution, differentiation and sexual development of fungi are regulated by several sex genes, such as mating type, pheromone factors and heterotrimeric G-protein-subunit genes. At the same time, regulatory factor pheromone sexual reproduction of fungi are also well studied in.is an important group of fungi in filamentous ascomy fungi, and many filamentous ascospora genus and species contain pheromone factors. In nature, Most of thefungi are in the form of asexuality, but a small part of them also have sexual reproduction. In order to further study the effect of pheromone receptor STE2 and its related genes on the sexual reproduction of typical species of the, this study selected, a typical species of the genus, containing the pheromone factor STE2, and cloned and identified the information receptor STE2, and then constructed on the bait protein expression vector, the cDNA library is screened to obtain several suspected interaction protein fragments, and the full length of the gene is cloned into the prey protein expression vector, and the split ubiquitinated membrane yeast two-hybrid system was used to perform one-to-one validation screening of STE2 related interaction protein. The results of the interaction protein screened by this study provide the basic premise for the later CO-IP and Poll-Down experiments.

Pheromone factor STE2;; split ubiquitin yeast two-hybrid system; interaction protein

S763.15; Q7

A

1000-2324(2019)01-0035-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.007

2018-05-12

2018-07-02

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(31230001)

劉小縵(1991-),女,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學(xué)和真菌資源. E-mail:2231969708@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wxm820@126.com