王儷穎,梁濤,朱彤彤,馬艷飛,江偉霖,冀瑞卿*,張修國*

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瞬時沉默乙醛脫氫酶對辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR129113功能的影響

王儷穎1,梁濤1,朱彤彤2,馬艷飛2,江偉霖2,冀瑞卿1*,張修國2*

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心, 吉林 長春 130118 2. 山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山東 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）產(chǎn)生的效應(yīng)因子RxLR129113在本氏煙上的功能之一是抑制BAX引起的細(xì)胞壞死，而且已經(jīng)證實(shí)乙醛脫氫酶（ALDH）是RxLR129113的互作蛋白。為了探究乙醛脫氫酶（ALDH）是否影響Rx LR129113抑制BAX引起的細(xì)胞壞死，本研究利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，克隆了乙醛脫氫酶（ALDH）基因片段，插入到煙草脆裂病毒載體（TRV）中，構(gòu)建了pTRV -ALDH的VIGS載體，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌侵染本氏煙后qrt-PCR驗(yàn)證成功沉默了ALDH基因。在沉默ALDH基因的本氏煙上瞬時表達(dá)RxLR129113，24 h接種BAX。結(jié)果表明，在NbALDH沉默植株上，RxLR129113仍然抑制BAX引起的細(xì)胞壞死。本研究結(jié)果表明RxLR129113與ALDH互作不影響其抑制BAX引起的細(xì)胞壞死，為進(jìn)一步深入開展辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR129113功能機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

辣椒疫霉; 實(shí)時熒光定量PCR; 基因沉默（VIGS）技術(shù); 表達(dá)量

辣椒疫霉菌() 是一種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要的土傳病原菌，可引起辣椒、甜椒、黃瓜、茄子、大豆等9科20多種作物的莖腐、根腐和枯萎[1]。卵菌侵染寄主植物時會分泌大量的效應(yīng)分子，依據(jù)效應(yīng)蛋白分子在植物細(xì)胞的靶標(biāo)位點(diǎn)，可將其劃分為兩大類群，一類是胞間效應(yīng)蛋白（Apoplastic effector），在植物細(xì)胞間累積，通過與胞間靶標(biāo)蛋白或細(xì)胞膜受體結(jié)合發(fā)生作用；另一類是胞內(nèi)效應(yīng)蛋白（Cytoplasmic effector）[2]，分泌病菌胞外后，轉(zhuǎn)至寄主植物細(xì)胞內(nèi)，通過作用于寄主植物胞內(nèi)靶標(biāo)抑制寄主的防衛(wèi)反應(yīng)，或被植物抗病蛋白識別激發(fā)過敏性壞死反應(yīng)，如卵菌效應(yīng)蛋白Avr1b和Avr3a，均可被寄主抗病蛋白識別，激發(fā)過敏性壞死反應(yīng)。其中RxLR效應(yīng)分子屬于胞內(nèi)效應(yīng)蛋白。RxLR效應(yīng)分子的N端有一段RxLR-dEER基序的基因序列[3]，其中x為任意氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，卵菌含有RxLR-dEER基序的效應(yīng)蛋白在病原物與植物互作過程中具有抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)的作用，其模式蛋白分為兩個功能區(qū)：N端區(qū)，包括信號肽和RxLR motif起到外泌和定位的作用，其余的C端區(qū)則表現(xiàn)效應(yīng)因子的活性區(qū)，常有W、Y、L、K保守域[4]。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）是發(fā)現(xiàn)于高等植物的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是宿主抵抗病毒的一種自我保護(hù)機(jī)制[5]。病毒侵染植物組織后進(jìn)行復(fù)制，合成大量的雙鏈RNA中間體（Double stranded RNA，dsRNA），隨之宿主體內(nèi)具有核酸內(nèi)切酶活性的Dicer類似物將其切割為小分子干擾RNA（small interfering RNA，si RNA），si RNA與一系列AGO（argonaute）家族蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），后者特異性識別細(xì)胞質(zhì)中的同源mRNA，并將其切割降解，從而發(fā)生基因在轉(zhuǎn)錄水平的沉默[6-8]。病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是近年發(fā)展起來研究植物基因功能的新方法[9]。利用含有目的基因片段的病毒載體侵染植物，導(dǎo)致植物體內(nèi)相應(yīng)的基因表達(dá)受到抑制成為沉默基因，可以初步推測目的基因的功能。與轉(zhuǎn)基因、基因敲除等基因功能研究方法相比，VIGS技術(shù)具有研究周期短、不需要遺傳轉(zhuǎn)化、低成本、高通量的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于植物生長發(fā)育以及代謝調(diào)控途徑相關(guān)基因的功能鑒定[10]。

煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）是目前應(yīng)用最廣泛的VIGS載體，它便于外源序列的插入和隨后對植物的侵染，具有病毒感染癥狀輕、沉默效率高等優(yōu)點(diǎn)，在煙草、擬南芥等多種植物上得到了廣泛應(yīng)用[11]。RxLR129113與乙醛脫氫酶（ALDH）通過酵母雙雜，Co-IP和雙分子熒光證明互作。本實(shí)驗(yàn)以乙醛脫氫酶（ALDH）為沉默對象，實(shí)驗(yàn)室本氏煙為供試材料，進(jìn)而在已沉默乙醛脫氫酶（ALDH）的本氏煙上驗(yàn)證RxLR129113是否抑制BAX引起的壞死。研究結(jié)果為RxLR129113與乙醛脫氫酶（ALDH）的互作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試煙草為本實(shí)驗(yàn)室保存的本氏煙。本氏煙種植于溫室，溫度25 ℃左右，光照14 h，黑暗10 h,，萌發(fā)3~4周的煙草幼苗適用。

Trans5α、GV3101購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；內(nèi)切酶FastDigest Kpn I、FastDigest Xba I購自ThermoFisher Biotechnology Company。pTRV﹕RNA1質(zhì)粒和pTRV﹕RNA2質(zhì)粒由清華大學(xué)劉玉樂老師惠贈。

1.2 引物設(shè)計(jì)

應(yīng)用Primier Quest Tool（http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index）軟件對乙醛脫氫酶（ALDH）特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物。通過Blast program（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對所設(shè)計(jì)的引物序列與其它生物種屬之間的同源性及其同源二聚體的有無。引物由上海博尚基因公司合成后對特異性進(jìn)行篩選與評價。

1.3 VIGS載體的構(gòu)建

選取NbALDH基因的全長cDNA序列信息設(shè)計(jì)引物，選取300 bp左右的序列，兩端引入限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xba I的酶切位點(diǎn)。通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到NbALDH基因片段。將此片段克隆到pTRV: RNA2載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，PCR驗(yàn)證并測序，測序正確，提質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.4 VIGS實(shí)驗(yàn)

將上述攜帶3種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌（pTRV1、pTRV2和pTRV2—ALDH）分別在28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。4000 rpm離心5 min收集農(nóng)桿菌，充分倒盡上清后，用農(nóng)桿菌滲透液重懸細(xì)菌調(diào)整農(nóng)桿菌懸浮液的OD600值為1.0左右，靜置3~5 h后，將等體積的pTRV1農(nóng)桿菌懸浮液和pTRV2－ALDH農(nóng)桿菌懸浮液混合均勻后，開始注射本氏煙草葉片。所注射的本氏煙草為萌發(fā)3~4周的幼苗，具有4~6片真葉的茁壯生長的植株，用注射器將混合菌液通過壓迫注射法接種煙草葉片。

1.5 RNA的提取，cDNA合成與純度、濃度檢測

在本氏煙接種TRV病毒后10 d，采用OMEGA植物RNA提取試劑盒進(jìn)行本氏煙RNA提取，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作提取RNA。以RNA為模板，參照諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，在冰上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系如下：4×gDNA wiper Mix 4 μL，模板RNA 1 μg，RNase free dd H2O to 16 μL，42 ℃ 2 min；在第一步反應(yīng)管中直接加入5×Hi ScriptⅡq RT Super MixⅡ4 μL，第一步反應(yīng)液16 μL；50 ℃ 15 min，85 ℃5 s。用分光光度計(jì)檢測樣品的濃度與純度，并將cDNA的濃度稀釋到0.1 μg·μl-1，-20 ℃保存。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以稀釋后的cDNA為模板，構(gòu)建實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個反應(yīng)3次重復(fù)。反應(yīng)體系為2*Super Real Pre Mix Plus 10 μL，上下游引物各0.4 L，cDNA模板4 μL，dd H2O補(bǔ)足至20 μL。以模板DNA濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)(Ct)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 沉默乙醛脫氫酶的本氏煙瞬時表達(dá)RxLR129113

若驗(yàn)證在本氏煙上已經(jīng)瞬時沉默了乙醛脫氫酶，將Rx LR129113，GFP，BAX分別在28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。4000 rpm離心5 min收集農(nóng)桿菌，充分倒盡上清液后，用農(nóng)桿菌滲透液重懸細(xì)菌調(diào)整OD600值為0.5左右，靜置3~5 h后，在本氏煙草葉片接種RxLR129113，24 h后接種BAX。

1.8 臺盼藍(lán)染色

配制臺盼藍(lán)染色液原液：取10 g苯酚、10m L乳酸、10m L甘油、10m L水和0.02 g臺盼藍(lán)混勻；配制水合氯醛脫色液：將1000 g水合氯醛溶于400 mL水中；先將配制好的臺盼藍(lán)原液加2倍體積的95%酒精稀釋，取適量的染色液（根據(jù)葉片的多少而定）加到燒杯中，水浴預(yù)熱1 min，加入接種的葉片，煮沸1~2 min，過夜放置；第2天將葉片轉(zhuǎn)移到配好的水合氯醛脫色液中，反復(fù)更換水合氯醛脫色液數(shù)次，直到壞死部位呈藍(lán)色，其他葉片組織呈透明色；將處理好的葉片放入95%酒精中，使葉片的對比度更加明顯，并且使葉片變得結(jié)實(shí)，利于進(jìn)一步的照相；將染色后的葉片照相，與未染色的葉片一一對應(yīng)。

圖 1 電泳檢測接種pTRV1+pTRV2和pTRV2-ALDH本氏煙的RNA

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

注射接種pTRV1和pTRV2－ALDH菌液10~14 d后，以pTRV1和pTRV2為對照，對葉片進(jìn)行RNA的提取。提取RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，OD260/OD280 值均在1.9~2.0之間，說明所提取的總RNA純度較高，OD260/OD230 值均在2.0左右，說明提取的RNA沒有鹽離子污染。1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示28SrRNA、18SrRNA兩條帶清晰銳利(圖1)，表明RNA未出現(xiàn)降解現(xiàn)象，符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 NbALDH基因沉默的熒光定量PCR結(jié)果

NbALDH在本氏煙中的表達(dá)量是相對于Nbactin的表達(dá)量而確定的。以接種pTRV1和pTRV2 的本氏煙作為對照，檢測NbALDH的表達(dá)量。從圖2-1，2-2的熒光定量PCR結(jié)果可以得出本氏煙的NbALDH基因沉默效率達(dá)70~80%，即沉默成功。

圖 2-1 NbALDH熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

Fig.2-1 Real-time fluorescence quantitative standard curve of NbALDH

圖 2-2 NbALDH熒光定量PCR表達(dá)模式分析

Fig.2-2 Real-time fluorescence expression patterns of NbALDH

2.3 沉默乙醛脫氫酶的本氏煙上瞬時表達(dá)RxLR129113能抑制BAX引起的細(xì)胞壞死

以GFP、Buffer作為對照在沉默乙醛脫氫酶本氏煙上瞬時表達(dá)RxLR129113，24 h后接種能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的BAX，以接種pTRV1和pTRV2的本氏煙為對照。接種一周后觀察RxLR129113能夠抑制BAX引起的細(xì)胞死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3（左），3（右）。

圖 3 RxLR129113分別在pTRV1+pTRV2（左）和沉默ALDH（右）本氏煙上抑制細(xì)胞死亡分析

Fig.3 Analysis of inhibition of cell death by effector RxLR129113 on pTRV1+pTRV2 (left) and silenced ALDH (right)

A：Rx LR129113+24 h BAX；B：GFP+24 h BAX；C：Buffer+24 h BAX，接種7 d后照相. 右圖是臺盼藍(lán)染色結(jié)果

A: Rx LR129113+24 h BAX; B: GFP+24 h BAX; C: Buffer+24 h BAX, photographs was taken in 7 days post‐inoculation (dpi). Right photograph is the trypan blue staining result.

3 討論

本研究采用的VIGS載體都是以天然植物病毒為基礎(chǔ)的，某些VIGS載體就會有一些物種特異性的限制。迄今為止，煙草脆裂病毒載體是使用最廣泛的VIGS載體，與其他病毒載體相比，TRV-VIGS載體具有插入目的基因長，誘導(dǎo)基因沉默效率高，持久性長，對宿主不會造成明顯傷害等優(yōu)點(diǎn)[12-13]，在煙草、擬南芥等多種植物上得到了廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用煙草脆裂病毒為載體，在本氏煙上沉默NbALDH，驗(yàn)證了RxLR129113仍然抑制BAX引起的壞死。由此說明，RxLR129113與互作蛋白ALDH互作并不影響對BAX的抑制，可以繼續(xù)在本氏煙上沉默NbALDH驗(yàn)證RxLR129113的其它功能是否發(fā)生變化，為進(jìn)一步研究RxLR129113與互作蛋白ALDH互作機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Transient Silencing of Acetaldehyde Dehydrogenase on the Function ofRxLR129113

WANG Li-ying1, LIANG Tao1, ZHU Tong-tong2, MA Yan-fei2, JIANG Wei-lin2, Ji Rui-qing1, ZHANG Xiu-guo2*

1.130118,2.271018,

One of the functions of theeffector RxLR129113 onis to inhibit BAX-induced cell necrosis, and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) has been shown to be an interaction protein of RxLR129113. To investigate whether aldehyde dehydrogenase (ALDH) affects RxLR129113 inhibition of BAX-induced cell necrosis, this study cloned the aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene fragment and inserted it into tobacco using virus-induced gene silencing (VIGS) technology. In the fragile virus vector (TRV), the VIGS vector of pTRV-ALDH was constructed, and the ALDH gene was successfully silenced by qrt-PCR after agrobacterium infecting. RxLR129113 was transiently expressed onwith silenced ALDH gene, and BAX was inoculated 24 h. The results showed that RxLR 129113 still inhibited BAX-induced cell necrosis on NbALDH-silenced plants. The results of this study indicate that the interaction between RxLR129113 and ALDH does not affect the inhibition of BAX-induced cell necrosis, which lays a foundation for further research on the functional mechanism ofeffector RxLR129113.

; real-time fluorescent quantitative PCR; gene silencing (VIGS) technology; expression

S436.418.1+2

A

1000-2324(2019)01-0031-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.006

2018-04-23

2018-06-02

國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-25-03B)

王儷穎(1993-),女,在讀碩士研究生.研究方向:植物病原真菌學(xué)和真菌資源利用. E-mail:1479779905@qq.com

Author for correspondence. E-mail:jiruiqingjrq@126.com; Zhxg@sdau.edu.cn