毛湘冰，湯 俊，陳代文，余 冰，何 軍，鄭 萍，虞 潔，羅鈞秋，羅玉衡

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所/動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130）

乳酸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的固有菌群之一，近些年的研究表明，乳酸桿菌具有明確的益生菌特性，即可維持胃腸道健康[1-4]。鼠李糖乳酸桿菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）最初由Glodin和Gorbach從健康人的糞便中分離得到，也表現(xiàn)出了諸多益生菌特性，如高黏附能力、高抗病原活性和胃酸抗性[5-7]。本團(tuán)隊(duì)前期的研究已表明，飼糧中添加LGG可改善RV攻毒對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉的影響，而這一過(guò)程與其可改善仔豬免疫功能和空腸屏障功能有關(guān)[8-9]。

輪狀病毒（rotavirus，RV）是一種雙鏈RNA病毒，也是一種誘導(dǎo)幼齡動(dòng)物和嬰幼兒嚴(yán)重胃腸道損傷和腹瀉的主要病原；通過(guò)流行病學(xué)的研究表明，RV極易感染仔豬，于世界各地的豬場(chǎng)均有感染，且初生仔豬感染后的死亡率可達(dá)到100%，其在仔豬的易感部位集中于消化道前段（如空腸）[10-12]。但是，近年的研究表明，RV也會(huì)導(dǎo)致無(wú)菌豬回腸的損傷，且LGG的處理可以在一定程度上緩解RV對(duì)無(wú)菌豬回腸的影響[13]。目前，對(duì)于飼糧添加LGG是否可緩解RV感染影響正常仔豬回腸黏膜屏障功能尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)?zāi)康臑榭疾祜暭Z中添加LGG對(duì)RV感染仔豬回腸屏障功能的影響，以期進(jìn)一步完善LGG緩解RV感染對(duì)機(jī)體影響的可能因素，這也將為L(zhǎng)GG作為益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用和推廣提供試驗(yàn)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

LGG菌粉：1010CFU/g，脫脂乳包被（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心提供）。

RV：OSU（G5P9）毒株（ATCC#VR-893），購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，選取24頭平均體重約為6.69 kg健康的斷奶仔豬（“杜×長(zhǎng)×大”），兩個(gè)因子分別為L(zhǎng)GG處理（添加或不添加109CFU/kg LGG飼糧）和RV攻毒（灌服輪狀病毒或無(wú)菌培養(yǎng)液）。全部仔豬采用代謝籠單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)第1 d空腹稱重后，根據(jù)同質(zhì)原則，將所有仔豬隨機(jī)分為2個(gè)處理，每個(gè)處理12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧或添加109CFU/kg LGG飼糧。試驗(yàn)第15 d，所有仔豬灌服100 mmol/L NaHCO3溶液5 mL，20 min后，每個(gè)飼糧處理中隨機(jī)選取6頭仔豬口服RV（1.4×107TCID50/mL）3 mL，剩余仔豬口服無(wú)菌培養(yǎng)液3 mL。此攻毒方法按本項(xiàng)目組前期研究發(fā)表的文獻(xiàn)[8，14-16]進(jìn)行。試驗(yàn)期為19 d。

1.3 試驗(yàn)飼糧及營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參照NRC（2012）7～11 kg階段仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制。通過(guò)在基礎(chǔ)飼糧中添加0或109CFU/kg LGG構(gòu)成試驗(yàn)飼糧，添加的LGG等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米。基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.4 飼養(yǎng)管理

仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地進(jìn)行。所有仔豬預(yù)飼2 d，使其適應(yīng)粉狀飼糧和飼養(yǎng)環(huán)境。豬舍溫度控制在27～30℃，相對(duì)濕度不高于80%，每天飼喂4次（08∶00、12∶00、16∶00和20∶00），以每次采食后料槽有少量余料為度。所有仔豬自由飲水，試驗(yàn)期間消毒、清掃按常規(guī)程序進(jìn)行，并保持豬舍通風(fēng)、清潔。

1.5 RV培養(yǎng)

RV的培養(yǎng)、強(qiáng)化和病毒滴度測(cè)定選用恒河猴腎細(xì)胞系（MA104）進(jìn)行，具體操作方法按文獻(xiàn)[14]。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 腹瀉率

攻毒后，每天進(jìn)行糞便評(píng)分（0：正常；1：黏性糞便；2：半液體狀糞便；3：液體狀糞便）；當(dāng)糞便評(píng)分≥2時(shí)，記為腹瀉。記錄的相關(guān)數(shù)據(jù)用于計(jì)算每個(gè)處理組每天的腹瀉率。

1.6.2 樣品采集

試驗(yàn)第20天，通過(guò)心臟注射戊巴比妥鈉（50mg/kg體重）和頸靜脈放血的方法屠宰所有仔豬，迅速取出回腸，并用冰生理鹽水沖洗。取3 cm的回腸固定于4%多聚甲醛溶液中，并通過(guò)載玻片刮取回腸黏膜，存于-80℃。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 The composition and nutrition levels of basal diets %

1.6.3 回腸黏膜形態(tài)的檢測(cè)

仔豬回腸黏膜形態(tài)（絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度）的測(cè)定參考Mao X.B.等[15]的方法進(jìn)行。

1.6.4 回腸黏膜輪狀病毒抗體和非結(jié)構(gòu)蛋白4的檢測(cè)

稱取約1 g回腸黏膜組織，按重量體積比1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，置于冰上勻漿后，勻漿液于冷凍離心機(jī)中以5 000 r/min離心10 min，取上清液用于指標(biāo)檢測(cè)。

仔豬回腸黏膜中RV抗體（rotavirus-antibody，RVAb）和非結(jié)構(gòu)蛋白4（non-structural protein 4，NSP4）的濃度，采用上海諾淵有限公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒測(cè)定，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.5 回腸黏膜中緊密連接蛋白和黏液蛋白基因表達(dá)

仔豬回腸黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定，具體方法參考Mao X.B.等[16]進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行初步整理，除了腹瀉率的數(shù)據(jù)外，其他數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件中兩因子方差分析，模型主效應(yīng)包括RV攻毒和飼糧添加LGG以及二者之間的互作，差異顯著后進(jìn)行Duncan氏多重比較，各指標(biāo)以每個(gè)重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以P＜0.05為差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 斷奶仔豬腹瀉率和回腸黏膜RV-Ab、NSP4濃度

從圖1和表2中可以看出，未攻毒的對(duì)照組和LGG組（即RV-CON和RV-LGG）未發(fā)生腹瀉，且RV攻毒誘導(dǎo)了仔豬的腹瀉發(fā)生，提高了回腸黏膜中RV-Ab和NSP4的含量（P＜0.05）；而飼糧中添加LGG可以延緩仔豬腹瀉的發(fā)生，降低了腹瀉率，并降低了回腸黏膜中NSP4的含量（P＜0.05），但對(duì)RVAb含量無(wú)顯著影響。

2.2 斷奶仔豬回腸黏膜形態(tài)學(xué)

從表3可以看出，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度（P＜0.05），增加了回腸黏膜的隱窩深度（P＜0.05）；飼糧添加LGG顯著提高了回腸黏膜的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度（P＜0.05），有降低回腸黏膜隱窩深度的趨勢(shì)（P=0.08），且顯著緩解了RV攻毒對(duì)仔豬回腸黏膜的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度的影響（P＜0.05）。

圖1 飼糧添加LGG和/或RV攻毒對(duì)斷奶仔豬腹瀉率的影響Figure 1 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on rate of diarrhea in the weaned pigs

表2 飼糧添加LGG和/或RV攻毒對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜RV-Ab與NSP4含量的影響Table 2 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the contents of RV-Ab and NSP4 in the ileal mucosa of weaned pigs

表3 飼糧添加LGG和/或RV攻毒對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜形態(tài)學(xué)的影響Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the ileal mucosa morphology in weaned pigs

2.3 回腸黏膜緊密連接和黏液蛋白基因表達(dá)

從表4可以看出，RV攻毒顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表達(dá)（P＜0.05）；飼糧中添加POS顯著提高了回腸黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表達(dá)（P＜0.05），且顯著緩解了RV攻毒對(duì)仔豬回腸黏膜中這些基因表達(dá)的影響（P＜0.05）。

3 討論

腹瀉依然是目前我國(guó)仔豬養(yǎng)殖的重要影響因素，其在降低仔豬生長(zhǎng)性能的同時(shí)，甚至?xí)?lái)死亡，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益。RV是引起仔豬腹瀉的主要病毒性病原之一，RV的感染會(huì)引起嚴(yán)重的胃腸炎和腹瀉，這主要是由于RV可導(dǎo)致腸道屏障功能的損傷[14-17]。本項(xiàng)目成員所在實(shí)驗(yàn)室近些年一直致力于緩解RV影響的研究，進(jìn)而通過(guò)不斷摸索已成功的構(gòu)建了RV模型建立的方法，即口服碳酸氫鈉后對(duì)31～35日齡仔豬進(jìn)行口服RV液（106～107TCID50）3～4 mL，且這一劑量的RV灌服可誘導(dǎo)仔豬發(fā)生腹瀉、免疫紊亂和腸道屏障功能損傷，并開(kāi)展了不同營(yíng)養(yǎng)素緩解仔豬感染RV的探索。而本研究中RV灌注也造成了回腸黏膜屏障功能的損傷，提高了回腸黏膜中NSP4和RV-Ab含量，與之前研究中的RV攻毒結(jié)果一致，這些表明本試驗(yàn)已成功構(gòu)建了RV對(duì)仔豬的感染模型。

表4 飼糧添加LGG和/或RV攻毒對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接和黏液蛋白基因表達(dá)的影響Table 4 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the gene expression of tight junction and mucins in the ileal mucosa of weaned pigs

NSP4是RV產(chǎn)生的一種非結(jié)構(gòu)蛋白。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，RV在誘導(dǎo)腹瀉的過(guò)程中此非結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，NSP4已被作為RV感染的重要標(biāo)識(shí)之一[18]。本研究中，飼糧中添加LGG顯著降低了RV攻毒仔豬回腸黏膜中NSP4的含量，表明LGG能在一定程度上抑制RV對(duì)回腸的侵襲。已有的大量研究表明，腸道屏障功能在抵御各種病原侵襲中起至關(guān)重要的作用[19]，但本研究中，LGG未改善仔豬回腸黏膜特異性免疫屏障（如RV-Ab水平未受調(diào)節(jié)），因此，LGG限制RV侵襲回腸可能源于其改善了仔豬回腸的非特異性屏障機(jī)制。

腸道非特異性屏障機(jī)制由黏膜上皮完整性、上皮細(xì)胞間的緊密連接和黏膜膠質(zhì)層組成[19]。就相關(guān)的研究顯示，以形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定黏膜表面積可作為黏膜上皮完整性的評(píng)價(jià)方法[20]；腸上皮細(xì)胞間緊密連接的狀態(tài)可通過(guò)測(cè)定細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)量說(shuō)明[21]；腸道黏膜上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的黏液蛋白是黏膜膠質(zhì)層的重要組成[22]。本研究的結(jié)果表明，飼糧添加LGG可緩解RV攻毒對(duì)回腸黏膜形態(tài)及黏膜上皮緊密連接蛋白和黏液蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步證明了LGG抑制RV侵襲回腸的過(guò)程依賴于其對(duì)非特異性屏障機(jī)制的改善作用。

對(duì)比本團(tuán)隊(duì)前期有關(guān)飼糧中添加LGG對(duì)RV攻毒仔豬空腸黏膜屏障功能的研究結(jié)果[8]，可以發(fā)現(xiàn)，LGG對(duì)回腸的保護(hù)作用并未達(dá)到其在空腸中的效果，那么，RV侵襲部位的強(qiáng)度可能是影響LGG產(chǎn)生保護(hù)效果程度的重要因素。另外，對(duì)比Wu S.P.等[13]研究LGG處理對(duì)RV攻毒無(wú)菌豬回腸黏膜屏障功能的研究結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，LGG對(duì)RV感染的正常仔豬回腸黏膜屏障功能的改善作用優(yōu)于其對(duì)RV感染無(wú)菌豬的效果。因此，除了腸道黏膜非特異性屏障機(jī)制外，微生物屏障在LGG的保護(hù)過(guò)程中可能也發(fā)揮了重要的作用。

4 結(jié)論

飼糧中添加LGG可以緩解RV攻毒引起的腹瀉；而這一過(guò)程中，LGG處理的作用至少部分是依賴于其對(duì)RV攻毒仔豬回腸黏膜非特異性屏障和微生物菌群機(jī)制的改善作用。