金維維 陳 偉 龐 冉 張同禹 井申榮

(昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明650500)

在過去的十年里，手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是全世界嬰幼兒之間流行的高發(fā)傳染性疾病，特別是亞太地區(qū)[1]。先前的研究和流行病學(xué)調(diào)查顯示腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CVA16)是引起HFMD的最主要的病原體，近期的研究表明柯薩奇病毒A組6型(Coxsackievirus A6,CVA6)、柯薩奇病毒A組10型(Coxsackievirus A10,CVA10)和柯薩奇病毒B組5型(Coxsackievirus B5,CVB5)等相關(guān)的HFMD也在世界范圍內(nèi)爆發(fā)[2-4]。CVB5不僅可以引起手足病，而且還能引起心肌炎、無菌性腦膜炎和遲緩性麻痹的嚴(yán)重并發(fā)癥。特別是近期Colton等[5]的報道顯示CVB5能夠感染成年人，并且引起較嚴(yán)重的臨床癥狀。然而目前市場上仍沒有針對CVB5的抗病毒藥物及疫苗可供選擇。因此，CVB5的抗病毒研究及快速的臨床檢驗是十分迫切的。目前中外都未報道CVB5病毒VP1蛋白多克隆抗體的制備及應(yīng)用情況。本實驗成功構(gòu)建了CVB5 VP1結(jié)構(gòu)蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化了目的蛋白，制備了高效價的SD大鼠抗血清，并成功運用多克隆抗體檢測到了CVB5感染小鼠腦組織中的抗原。為CVB5的抗病毒藥物及疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 柯薩奇病毒B組5型(Coxscakievirus B 5,CVB5)由本實驗室保藏；RNA提取試劑盒RNAiso Plus (TaKaRa)；逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR試劑盒。大腸埃希菌(Escherichia.E.coli)DH5a、E.coli BL21(DE3) pET-28a/DH5a由本實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ購自賽默飛世科技(中國)有限公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和小量膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；IPTG，生工生物工程有限公司；Mous-anti-His單克隆抗體、Goat-anti-mouse IgG-HRP二抗和Goat-anti-Rat IgG-HRP二抗購自KPL公司。SPF級SD大鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物中心[SCXK(滇)(K2015000)]；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；DAB染色液。HisTrap HP蛋白純化預(yù)裝柱購自GE Health-care公司。

1.2方法

1.2.1VP1基因的獲取和原核表達(dá)載體的構(gòu)建 取本實驗室保藏的CVB5病毒200 μl提取總RNA，以目的片段下游引物逆轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，以該文庫為模板PCR擴增目的基因。引物序列如下：CVP1-F：CTAGCTAGCGGGCCCACAGGTGAGGCAG-T；CVP1-R：CCGCTCGAGGGTGGTCTGCATGGTTG-TTAT。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min、36個循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保存。NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-28a載體，膠回收，定量。酶切后的目的片段和載體(摩爾比為5∶1)用T4 DNA連接酶16℃連接3 h，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB固體培養(yǎng)基(Kan+)，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑單菌落過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒，NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送基因公司測序鑒定。

1.2.2重組載體的原核誘導(dǎo)表達(dá)及目的蛋白的純化 將測序驗證正確的重組載體轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB固體培養(yǎng)基(Kan+)，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑單菌落到含Kan+的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1%轉(zhuǎn)接，當(dāng)OD595到達(dá)0.4～0.6時加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h。取部分菌液鑒定初步鑒定目的蛋白是否表達(dá)，剩余部分超聲破碎檢驗蛋白是否為包涵體表達(dá)。大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，破碎收集包涵體沉淀，用包涵體洗滌液洗滌包涵體。用HisTrap親和層析柱純化目的蛋白，具體方法同以前的研究[6]。SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化后目的蛋白的純度，Western blot驗證純化所得蛋白是帶有His標(biāo)簽的目的蛋白。

1.2.3動物免疫及抗體的測定 本實驗選用8周齡的SD雄鼠作為免疫動物，首次免疫劑量是1 mg/kg，將純化后的蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻，皮下多點注射SD大鼠。在首次免疫后的第14和28天進(jìn)行加強免疫，加強免疫劑量為0.5 mg/kg，目的蛋白與弗氏不完全佐劑混合。最后一次免疫后一周對SD大鼠乙醚麻醉，心臟采血；血液37℃靜置1.5 h，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，收集血清，分裝，-80℃凍存。ELISA測定IgG抗體的效價，每孔包被1 μg純化的目的蛋白，梯度稀釋血清做一抗，二抗Goat-anti-Rat IgG-HRP按1∶2 500稀釋。每孔包被1×106TCID50CVB5活病毒，ELISA測定抗體效價。本實驗用微量中和法測抗體的中和效價，具體方法是：每孔1×104個Vero細(xì)胞鋪96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)20 h； 50 μl梯度稀釋的血清與50 μl稀釋好的CVB5(100TCID50)混合均勻，37℃孵育1 h，然后加入對應(yīng)的孔中，每個稀釋梯度做4個重復(fù)。Western blot分析中該抗體的應(yīng)用。每個泳道加1 μg純化的目的蛋白，梯度稀釋血清做一抗，二抗Goat-anti-Rat IgG-HRP按1∶10 000稀釋，ECL試劑盒顯色，Tanon-5200Multi全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.4Western blot檢測CVP1抗體對CVA16和EV71的交叉反應(yīng) Vero細(xì)胞分別培養(yǎng)本實驗室保藏的CVB5、CVA16和EV71病毒，細(xì)胞完全病變后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心10 min，收集上清即得到各病毒液。未接種病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液做陰性對照組，CVB5、EV71和CVA16病毒液為實驗組，CVP1抗體血清1∶10 000稀釋做一抗，1∶10 000稀釋Goat-anti-Rat IgG-HRP作二抗，ECL試劑盒顯色，Tanon-5200Multi全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)分析。

1.2.5免疫組化分析檢測該抗體對組織中抗原的識別 取CVB5感染的新生小鼠腦組織，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水，石蠟包埋，切3 μm厚度的切片。制得的抗體血清1∶50稀釋做一抗，1∶250稀釋的Goat-anti-mouse IgG-HRP做二抗，DAB顯色，倒置顯微鏡拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1重組載體的構(gòu)建與驗證 RT-PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示出一條850 bp左右的片段(圖1A)，與預(yù)期片段大小相符。重組VP1-pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切驗證，酶切產(chǎn)物電泳顯示有兩個條帶，小條帶850 bp左右(圖1B)，表明擴增出的VP1片段成功連接在了載體上。酶切驗證正確的重組質(zhì)粒送基因公司測序，測序結(jié)果與原序列通過DNAman軟件比對顯示相似度100%，表明RT-PCR擴增過程中未發(fā)生堿基錯配。

2.2VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 為確定目的蛋白能否原核表達(dá)，用重組載體轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2A泳道1、2所示，重組質(zhì)粒CVP1-pET-28a組35 KD左右的位置處有明顯條帶，而空載組沒有該條帶，初步證明目的條帶誘導(dǎo)表達(dá)成功。如圖2A泳道3、4所示，沉淀中有目的條帶，而上清中沒有，表明VP1蛋白在BL21細(xì)胞中以包涵體的形式存在。大量誘導(dǎo)表達(dá)并純化VP1蛋白，純化后的蛋白SDS-PAGE電泳顯示一條35 KD左右的單一條帶，灰度分析顯示其純度大于90%(圖2A泳道5)。如圖2B，用Anti-His單克隆抗體在35 KD處標(biāo)記處了目的蛋白。本實驗成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化了VP1蛋白。

圖1 VP1片段擴增及重組載體的驗證Fig.1 Amplification of VP1 fragment and verification of recombinant vectorNote: M1.DL2000TM DNA marker；1.RT-PCR amplified bands；M2.DL5000TM DNA marker;2.NdeⅠ/XhoⅠ double enzyme digestion system.

圖2 VP1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定Fig.2 Expression，purification and identification of VP1 proteinNote: M.Protein predyed marker;1.pET-28a/BL21 (IPTG induced);2.VP1-pET-28a/BL21 (IPTG induced);3.The supernatant of VP1 protein strain after ultrasonic fragmentation;4.The precipitation of VP1 protein strain after ultrasonic fragmentation;5.VP1 protein purified by HisTrap HP affinity chromatography column;6.VP1-pET-28a/BL21 (IPTG induced);7.pET-28a/BL21 (IPTG induced) respectively.

2.3抗體效價的測定 SD大鼠最后一次免疫一周后心臟取血，制備血清，間接ELISA實驗測定其效價。陽性判定依據(jù)是待測血清與抗原反應(yīng)孔的A450值/陰性血清與抗原反應(yīng)孔的A450值≥2.1。當(dāng)抗原是純化的目的蛋白時，計算的待測抗體的效價為1∶128 000。當(dāng)抗原為活的CVB5病毒時，計算的待測抗體的效價為1∶32 000 。

為確定抗體是否對CVB5病毒具有中和活性，我們微量中和法測定其中和效價。結(jié)果顯示其中和效價小于1∶2，表明我們制備的抗體沒有中和活性。

本實驗還探索了Western blot分析中該抗體的應(yīng)用，結(jié)果如圖3所示，血清1∶10 000稀釋時條帶清晰，而1∶12 000稀釋時條帶開始模糊，表明在Western blot分析中該抗體的最大稀釋比為1∶10 000。

2.4抗體對CVA16和EV71的交叉反應(yīng) 為確定制備的CVB5的抗體與CVA16和EV71的反應(yīng)，用微量分光光度儀分別對Vero細(xì)胞中增殖的CVB5、CVA16和EV71病毒液及未接種任何病毒的陰性對照組溶液進(jìn)行蛋白定量。每個泳道上總蛋白20 μg，抗體1∶5 000稀釋做一抗進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖4所示，CVB5組和CVA16組條帶清晰，而EV71組條帶很淡。表明CVB5抗體對CVA16有很強的交叉反應(yīng)，對EV71的交叉反應(yīng)卻很弱。

2.5免疫組化實驗結(jié)果 為確定抗體能否識別機體中的CVB5抗原，進(jìn)行免疫組化分析。免疫組化實驗中用1∶50稀釋的血清做一抗，來標(biāo)記CVB5感染的新生小鼠的腦組織石蠟切片中的CVB5抗原；陰性血清做對照。圖5A為對照組片子，其中沒有棕色顆粒物，而實驗組中則有明顯的棕色顆粒，即圖5B中箭頭所指示，表明制得的抗體可用于免疫組化實驗。

圖3 抗體在Western blot分析中稀釋比選擇Fig.3 Selection of dilution ratio of antibody in Western blot analysisNote: M.Protein prestained with marker;1，2，3 and 4，respectively，as antibody serum diluted by 1∶4 000，1∶8 000，1∶10 000 and 1∶12 000.

圖4 抗體對CVA16和EV71的交叉識別能力Fig.4 Cross recognition ability of antibody to CVA16 and EV71

圖5 抗體識別腦組織CVB5抗原的免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig.5 Immunohistochemical staining results of CVB5 antigen identified by antibody in brain tissue(×200)

3 討論

近年來CVB5在世界范圍內(nèi)開始流行，如2006年在法國有23%的腦膜炎患者確定為CVB5感染[7]；在2003年至2004年，希臘也報道了CVB5引起的無菌性腦膜炎的流行[8]；在2005年和2009年，我國山東和河南也爆發(fā)了CVB5感染引發(fā)的無菌性腦膜炎[9]。雖然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但腦膜炎的疾病是有后遺癥的。因此，CVB5的抗病毒藥物及疫苗的研究和快速的臨床診斷是非常迫切的。疫苗研究及臨床診斷都需要用特異性抗體來檢測病毒抗原。Opanda等[10]的研究表明，CVB5病毒顆粒的主要中和抗原表位位于VP1區(qū)。綜上，本研究將目標(biāo)瞄向了CVB5衣殼亞單位VP1蛋白多克隆抗體的制備。本實驗成功構(gòu)建了CVB5 VP1基因的原核表達(dá)載體VP1-pET-28a，并將其在BL21細(xì)胞中大量誘導(dǎo)表達(dá)。重組VP1蛋白C、N兩端都有His標(biāo)簽，因此我們利用HisTrap HP親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化。純化后的目的蛋白純度大于90%，符合多克隆抗體制備的要求。純化后的目的蛋白與弗氏佐劑混合后，分多次、多位點皮下注射免疫SD大鼠，獲得了VP1蛋白的多隆抗體。檢測發(fā)現(xiàn)多克隆抗體幾乎沒有中和活性，原因可能是VP1蛋白原核表達(dá)后沒有進(jìn)行正確的修飾和折疊，未能形成中和表位，因此產(chǎn)生的抗體沒有中和活性。經(jīng)ELISA測定其效價高達(dá)1∶128 000，并且在Western blot實驗中抗體最大稀釋比可達(dá)1∶10 000。Western blot分析顯示抗體對CVA16有很高的交叉反應(yīng)，對EV71的交叉反應(yīng)較弱。序列比對發(fā)現(xiàn)CVB5與CVA16和EV71的VP1基因有較高的同源性，這是造成交叉反應(yīng)的主要原因。免疫組化實驗顯示抗體能夠標(biāo)記出組織中的CVB5抗原。免疫組化實驗顯示抗體能夠標(biāo)記出組織中的CVB5抗原。綜上所述，抗體即能用于ELISA分析和Western blot,也能用于免疫組化分析。這些應(yīng)用是疫苗及抗病毒藥物研究的關(guān)鍵；因此，制備的多克隆抗體血清在CVB5抗病毒藥物及疫苗的研發(fā)、CVB5感染相關(guān)動物模型的建立中都可得到有效利用。遺憾的是我們制備的都克隆抗體沒有中和活性，所以沒用做治療性抗體的可能,并且由于該抗體對CVA16和EV71有交叉反應(yīng)，所以也不能應(yīng)用于精確的臨床診斷。