李春雙 黃 娟 侯金蘭 郭 紅 張 蕾 白 潔 張 釗 張連蓮 李世龍

(唐山市工人醫(yī)院呼吸內(nèi)科，唐山063500)

肺癌是在臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，近年來(lái)，我國(guó)肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給人民的生命及健康造成極大的威脅[1-3]。腫瘤的形成和惡性轉(zhuǎn)化是一個(gè)與癌基因的激活、抑癌基因的失活等的多步驟、多基因、多階段的過(guò)程，肺癌中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)分子靶向治療位點(diǎn)，但仍需尋找更多的位點(diǎn)[4,5]。微絲附著梁蛋白(Girders of actin filaments，Girdin)是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的大分子蛋白，是2005年首次被發(fā)現(xiàn)的一種新的AKT下游底物，在其C端1416位具有絲氨酸磷酸化作用位點(diǎn)，可特異性地與AKT的C端結(jié)合協(xié)同促進(jìn)其磷酸化和激酶活性[6]。以往研究顯示，Girdin可影響細(xì)胞極性、神經(jīng)母細(xì)胞遷移、肌動(dòng)蛋白重建、血管生成、細(xì)胞自噬等，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中有高表達(dá)，且多與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[7-9]。惡性膠質(zhì)瘤中Girdin高表達(dá)患者預(yù)后差[10]；肝癌細(xì)胞中抑制Girdin表達(dá)可明顯降低癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[11,12]。Girdin對(duì)肺癌的研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中Girdin的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，可能是判斷患者預(yù)后有價(jià)值的靶點(diǎn)[13,14]。順鉑是腫瘤治療中聯(lián)合化療常用的一個(gè)藥物，對(duì)肺癌的治療起到輔助作用[15,16]。目前關(guān)于Girdin對(duì)肺癌生物學(xué)特性的影響及是否可增加肺癌的化療敏感性還尚不清楚。本研究通過(guò)RNAi沉默肺癌細(xì)胞Girdin表達(dá)，旨在研究Girdin對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、免疫因子及化療敏感性的影響，并研究是否能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路起作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 順鉑購(gòu)江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takala；兔抗人Girdin多克隆抗體、兔抗人細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體、兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)多克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體、兔抗人磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)多克隆抗體、兔抗人磷酸化的絲氨酸蘇氨酸激酶(Phosphorylated Serine/threonine kinase，p-AKT)多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell signal公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.1.2細(xì)胞及其培養(yǎng) 人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5及肺癌A549、PC9、SPC-A-1、H322、H1299細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞在含有10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

1.2方法

1.2.1Girdin在肺癌細(xì)胞的表達(dá) RT-PCR簡(jiǎn)要步驟如下：細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA參照總RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，以cDNA為模板上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，之后95℃、10 s，58 ℃退火30 min，共35個(gè)循環(huán)，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。Girdin的引物序列為F：5′-GACCAACTAGAGGGAACTCG-3′，R：5′-TACTTTGTTTCTGTGCCATT-3′。內(nèi)參GAPDH 的引物為F：5′-GTCACCAGGGCTGCTTTTAACTC-3′，R：5′-CAGCATCGCCCCACTTGATTTTG-3′。采用2-ΔΔCt比較法根據(jù)Ct均值對(duì)Girdin的mRNA相對(duì)含量進(jìn)行定量。

Western blot簡(jiǎn)要步驟如下：細(xì)胞中加入適量的裂解液，裂解完全后離心，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白液與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃變性10 min，每泳道加入40 μg樣品行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后4℃孵育一抗過(guò)夜，Girdin和內(nèi)參GAPDH抗體均按照1∶1 000稀釋，洗膜，加入按照1∶2 000 稀釋二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔)，室溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法在紫外凝膠成像儀上進(jìn)行拍照分析。Girdin的相對(duì)表達(dá)通過(guò)Girdin的灰度值除以GAPDH的灰度值計(jì)算。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞 SPC-A-1細(xì)胞分為空白對(duì)照組(只加入脂質(zhì)體)、陰性對(duì)照組(NC組，轉(zhuǎn)染合成的無(wú)干擾作用的siRNA)、Girdin-siRNA(轉(zhuǎn)染合成的特異性的干擾Girdin表達(dá)的siRNA)組、順鉑組(2.5 mg/L順鉑干預(yù))和Girdin-siRNA+順鉑組，轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明。通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)Girdin的siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞效果。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測(cè) 收集處理48 h的各組細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育細(xì)胞4 h，吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，在每個(gè)細(xì)胞孔中加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，10 min后，用空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)，以此反映細(xì)胞活力，間接反映出細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)處理48 h的各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照試劑盒的操作進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞中免疫因子檢測(cè) 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-8和TNF-α的表達(dá)，方法參照1.2.1。

1.2.6增殖凋亡蛋白及PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè) 增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax及PI3K/AKT信號(hào)通路PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)參照1.2.1方法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1Girdin在肺癌細(xì)胞表達(dá) 以人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5作為對(duì)照細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Girdin在肺癌細(xì)胞的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)Girdin的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1和表1所示，五個(gè)肺癌細(xì)胞中Girdin的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯高于在MRC5細(xì)胞表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2Girdin-siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 Girdin-siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Girdin的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2和表2所示，Girdin-siRNA組Girdin的蛋白表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而陰性對(duì)照組Girdin的蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Western blot檢測(cè)Girdin在肺癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of Girdin protein in lung cancer were detected by Western blot

2.3Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響 通過(guò)MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值(OD值)，以此反映細(xì)胞活力，間接反映出細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如表3所示，Girdin-siRNA組和順鉑組均能減低肺癌細(xì)胞OD值，與空白對(duì)照組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞OD值影響優(yōu)于Girdin-siRNA組和順鉑組(P<0.05)。

表1Girdin在肺癌細(xì)胞中的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量

Tab.1mRNAandproteinexpressionofGirdininlungcancercells

CellsGirdin mRNAGirdin proteinMRC510.051±0.008H3222.883±0.5621)0.247±0.0321)PC93.432±0.6111)0.383±0.0451)H12992.955±0.6021)0.223±0.0181)SPC-A-14.787±0.7421)0.572±0.0621)A5493.954±0.6831)0.435±0.0511)F14.15861.123P<0.05<0.05

Note：Compared with MRC5 cells，1)P<0.05.

圖2 Girdin-siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞后Girdin的蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of Girdin protein in SPC-A-1 cells transfected with Girdin-siRNA

表2Girdin-siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞后Girdin的蛋白表達(dá)

Tab.2ExpressionofGirdinproteininSPC-A-1cellstransfectedwithGirdin-siRNA

GroupsRelative expression of Girdin proteinBlank group0.425±0.039NC group0.437±0.041Girdin-siRNA group0.113±0.0151)F88.619P<0.05

Note：Compared with blank group，1)P<0.05.

2.4Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如圖3和表4所示，Girdin-siRNA組和順鉑組均能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，與空白對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡影響優(yōu)于Girdin-siRNA組和順鉑組(P<0.05)。

2.5Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞IL-8和TNF-α表達(dá)的影響 IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如表5所示，Girdin-siRNA組和順鉑組IL-8和TNF-α的表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)IL-8和TNF-α表達(dá)的影響優(yōu)于Girdin-siRNA組和順鉑組(P<0.05)。

表3Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響

Tab.3EffectofGirdinonproliferationofSPC-A-1cells

GroupsOD570 nmBlank group0.693±0.058Girdin-siRNA group0.482±0.0451)2)Cisplatin group0.431±0.0441)2)Girdin-siRNA+cisplatin group0.301±0.034F37.624P<0.05

Note：Compared with blank group，1)P<0.05;compared with Girdin-siRNA+cisplatin group，2)P<0.05.

圖3 Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Girdin on apoptosis of SPC-A-1 cells

表4Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞凋亡的影響

Tab.4EffectofGirdinonapoptosisofSPC-A-1cells

GroupsApoptosis rate(%)Blank group1.65±0.45Girdin-siRNA group7.43±0.621)2)Cisplatin group9.78±0.781)2)Girdin-siRNA+cisplatin group13.95±1.02F141.440P<0.05

Note：Compared with blank group，1)P<0.05;compared with Girdin-siRNA+cisplatin group，2)P<0.05.

2.6Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞PCNA、Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax及PI3K/AKT信號(hào)通路PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表6所示，與空白對(duì)照組比較，Girdin-siRNA組和順鉑組Caspase-3、Bax表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，PCNA、PI3K和p-AKT表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，兩者聯(lián)合對(duì)Caspase-3、Bax、PCNA、PI3K和p-AKT表達(dá)影響優(yōu)于Girdin-siRNA組和順鉑組(P<0.05)。

表5Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞IL-8和TNF-α表達(dá)的影響

Tab.5EffectofGirdinonexpressionofIL-8andTNF-αinSPC-A-1cell

GroupsmRNA relative expressionIL-8TNF-αBlank group11Girdin-siRNA group0.453±0.0471)2)0.523±0.0631)2)Cisplatin group0.511±0.0561)2)0.606±0.0611)2)Girdin-siRNA+cisplatin group0.301±0.0320.383±0.045F172.31986.431P<0.05<0.05

Note：Compared with blank group，1)P<0.05;compared with Girdin-siRNA+cisplatin group，2)P<0.05.

圖4 Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞PCNA、caspase3、Bax、PI3K和p-AKT表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Girdin on expression of PCNA，caspase3，Bax，PI3K and p-AKT in SPC-A-1 cellsNote: 1.Blank control group;2.Girdin-siRNA group;3.Cisplatin group;4.Girdin-siRNA+cisplatin group.

表6Girdin對(duì)SPC-A-1細(xì)胞PCNA、Caspase-3、Bax、PI3K和p-AKT表達(dá)的影響

Tab.6EffectofGirdinonexpressionofPCNA，Caspase-3，Bax，PI3Kandp-AKTinSPC-A-1cells

GroupsRelative expression of proteinPCNACaspase-3BaxPI3Kp-AKTBlank group0.357±0.0420.105±0.0110.589±0.0740.437±0.0480.238±0.035Girdin-siRNA group0.195±0.0181)2)0.142±0.0151)2)0.341±0.0391)2)0.286±0.0351)2)0.135±0.0161)2)Cisplatin group0.181±0.0201)2)0.170±0.0201)2)0.256±0.0321)2)0.241±0.0321)2)0.120±0.0141)2)Girdin-siRNA+cisplatin group0.113±0.0120.222±0.0280.168±0.0210.135±0.0150.057±0.010F48.74619.06646.62439.44838.026P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

Note：Compared with blank group，1)P<0.05;compared with Girdin-siRNA+cisplatin group，2)P<0.05.

3 討論

肺癌是引起腫瘤死亡的一個(gè)主要原因，遺傳因素及環(huán)境對(duì)表觀遺傳的改變是一個(gè)重要原因[17,18]。因此，深入探究肺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中新的關(guān)鍵分子，并研究其機(jī)制，對(duì)于肺癌的治療具有重要意義。PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞生成等[19-23]。Girdin是一種新型的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，位于PI3K/AKT下游，在其C端1416位具有絲氨酸磷酸化作用位點(diǎn)，可特異性地與AKT的C端結(jié)合協(xié)同促進(jìn)其磷酸化和激酶活性[24,25]。目前在多種腫瘤包括子宮頸、膽管癌、消化道等組織樣本中均發(fā)現(xiàn)Girdin的普遍表達(dá)，且具有程度不同的高表達(dá)，因此普遍認(rèn)為Girdin對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用[26,27]。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Girdin的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲過(guò)程，抑制食管鱗癌中Girdin的表達(dá)可降低癌細(xì)胞侵襲及遷移能力[28，29]。Girdin對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及機(jī)制還未清楚。

本研究首先通過(guò)RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株中Girdin的表達(dá)，選擇高表達(dá)肺癌細(xì)胞株SPC-A-1為研究對(duì)象，RNA干擾(RNAi)技術(shù)可使靶序列降解，從而沉默基因表達(dá)，是近些年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)研究基因功能的新技術(shù)，目前也得到了廣泛的應(yīng)用[30-32]。通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將Girdin的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Girdin的siRNA后細(xì)胞中Girdin的蛋白表達(dá)明顯降低，說(shuō)明該序列可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。為了研究Girdin對(duì)肺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及是否可增強(qiáng)化療敏感性，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、Girdin-siRNA組、順鉑組和Girdin-siRNA組+順鉑組，通過(guò)MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)Girdin-siRNA和順鉑均能抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合效果更強(qiáng)。有研究顯示，抑制肺癌中PI3K/AKT信號(hào)通路可通過(guò)影響下游靶基因PCNA、Caspase-3和Bax的表達(dá)而阻止肺癌進(jìn)展[33]。PCNA是一個(gè)分子量為36 kD的非組蛋白，是合成DNA不可缺少的因子，可作為包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖檢測(cè)指標(biāo)[34]。Caspase-3屬于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的一個(gè)關(guān)鍵成員，是發(fā)揮凋亡作用的關(guān)鍵酶，活化的Caspase-3可使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[35,36]。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中Caspase-3表達(dá)降低，提高其表達(dá)后可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[37]。Bax為Bcl-2家族中的一員，發(fā)揮促凋亡作用，過(guò)表達(dá)Bax不僅可使多種細(xì)胞發(fā)生自發(fā)凋亡，而且可增加由多種因素引起的細(xì)胞凋亡[38,39]。IL-8和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，是反映肺癌體內(nèi)免疫的重要指標(biāo)[40]。為了檢測(cè)Girdin對(duì)肺癌增殖、凋亡機(jī)制及免疫的影響，通過(guò)Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PCNA、Caspase-3、Bax及PI3K/AKT信號(hào)通路PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)IL-8和TNF-α的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Girdin-siRNA和順鉑均能抑制PCNA、PI3K、p-AKT、IL-8和TNF-α表達(dá)，上調(diào)Caspase-3和Bax表達(dá)，兩者合用效果更強(qiáng)。

綜上所述，抑制肺癌細(xì)胞Girdin表達(dá)通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路降低癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高免疫，并增殖順鉑對(duì)癌細(xì)胞化療敏感性。對(duì)細(xì)胞增殖的影響是下調(diào)PCNA表達(dá)，凋亡的影響是上調(diào)Caspase-3和Bax表達(dá)。本研究結(jié)果初步證實(shí)了Girdin對(duì)肺癌增殖凋亡、免疫的影響，并可增加化療敏感性，可能作為肺癌分子診斷及靶向治療靶點(diǎn)，但本研究的內(nèi)容有限，還需更多的實(shí)驗(yàn)研究作進(jìn)一步的證實(shí)。