王佳南 林建安 杜苗苗

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，泉州362000)

急性心肌梗死(Acute myocardial infraction,AMI)是由冠狀動脈持續(xù)缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞壞死，可導(dǎo)致心力衰竭、惡性心律失常甚至猝死，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。研究表明，在缺血早期及時(shí)恢復(fù)血流供應(yīng)能有效減輕心肌組織的損傷，降低急性心肌梗死患者死亡率[2]。但目前的藥物和方法僅能影響急性心肌梗死患者中后期的預(yù)后[3]。自噬是降解長壽蛋白和受損細(xì)胞器的重要過程。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬在多類心血管疾病發(fā)展過程中也發(fā)揮了重要作用，并且在心臟疾病的不同時(shí)期和損傷的不同階段發(fā)揮著不同的作用[5]。促進(jìn)自噬能促進(jìn)心肌梗死小鼠心肌功能的恢復(fù)，但自噬小體的過度堆積也可進(jìn)一步加重心肌組織的損傷[5,6]。近年來研究表明[7,8]，中藥在治療缺血性心臟病方面具有較好的療效。丹參是我國傳統(tǒng)中藥，其提取物丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSⅡA)能通過調(diào)控PI3K信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，提示TSⅡA具有明顯的心臟保護(hù)作用[9]。但TSⅡA是否能通過調(diào)控線粒體自噬影響MI大鼠心臟功能的恢復(fù)還未見報(bào)道。本文采用冠狀動脈結(jié)扎的方法復(fù)制大鼠AMI模型，以探究TSⅡA對AMI大鼠心肌功能的作用及與線粒體自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑 清潔級SD大鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。HE染色液和RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司。Tunel細(xì)胞凋亡試劑盒購自瑞士Roche公司。BCA試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒購自碧云天生物科技公司。肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)、肌酸激酶同工酶(Creatine kinase MB,CK-MB)、肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin,cTnⅠ)、Beclin1、P62和LC3一抗購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型復(fù)制 將60只體重在220～280 g的清潔級SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照(Ctrl)組、MI組、TSⅡA(20)組、TSⅡA(50)組和TSⅡA(100)組，每組12只。將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定大鼠，連接呼吸機(jī)，呼吸頻率在50～60次/s范圍內(nèi)。隨后分離左側(cè)冠狀動脈，除Ctrl組外，用手術(shù)縫合線結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支，肉眼觀察結(jié)扎部位缺血組織蒼白或發(fā)紺，搏動減弱且心電圖Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段持續(xù)抬高視為造模成功。Ctrl組大鼠除不結(jié)扎前降支外，其他操作同上。模型復(fù)制成功后，TSⅡA(20)組、TSⅡA(50)組和TSⅡA(100)組大鼠每天分別腹腔注射20 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的TSⅡA，Ctrl組和MI組大鼠每天腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射3周。于處死前檢測各組大鼠平均動脈壓(Mean arterial pressure,MAP)、心率(Heart rate,HR)和左室收縮壓(Left ventricular systolic pressure,LVSP)，并分離心肌組織，計(jì)算心肌梗死面積。

1.2.2組織樣品準(zhǔn)備 將大鼠用10%水合氯醛麻醉后，用注射器于心臟取血，室溫靜置1 h后以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速將全血離心15 min，取上清液分裝后儲存于-20℃?zhèn)溆谩ｋS后立即取下心肌組織，將左心室平均分為3份。取一份用4%的多聚甲醛室溫固定4 h，以乙醇進(jìn)行梯度脫水后，采用二甲苯透明，隨后用石蠟包埋，制作5 μm的石蠟切片，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3線粒體提取 根據(jù)文獻(xiàn)[10]的報(bào)道方法，取下心臟組織后將組織剪碎并勻漿，采用差速離心法提取心臟組織線粒體。

1.2.4HE染色檢測心肌組織 取各組石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理，隨后用濃度從高到低的乙醇對切片進(jìn)行水化后，蒸餾水沖洗10 s，將切片放入蘇木精染色液中室溫染色20 min，再用自來水沖洗切片至切片變藍(lán)。將切片放入1%的鹽酸乙醇溶液中，10 s后取出用自來水沖洗。用乙醇溶液對切片進(jìn)行梯度脫水，脫水后將切片放入伊紅染色液中染色2 min，再次用高濃度乙醇進(jìn)行脫水，并用二甲苯透明，最后采用中性樹膠封片，于生物顯微鏡下觀察組織損傷情況。

1.2.5Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡 將石蠟切片用二甲苯和乙醇進(jìn)行脫蠟和水化處理后，根據(jù)Tunel試劑盒說明書對切片進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察凋亡小體的形成情況并統(tǒng)計(jì)。

1.2.6試劑盒檢測SOD、MDA和GSH濃度 取血清于4℃溶解后置于室溫復(fù)溫30 min，根據(jù)SOD、MDA和GSH試劑盒說明書檢測血清中SOD、MDA和GSH的濃度。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達(dá) 取用裂解液提取線粒體或組織總蛋白，用BCA蛋白定量測定試劑盒對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。將蛋白濃度調(diào)平后，每組取40 μg 總蛋白用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用緩沖液清洗后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，隨后加入適宜濃度一抗，4℃孵育過夜，第二天洗去未結(jié)合一抗，滴加二抗室溫反應(yīng)1 h，充分漂洗后加入化學(xué)反光顯色液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1TSⅡA對MI大鼠心肌功能的影響 如圖1所示，大鼠心肌梗死3周后，MI組大鼠MAP、HR和LVSP均明顯低于Ctrl組(P<0.01)；TSⅡA(20、50、100)組大鼠MAP、HR和LVSP與MI組比較均明顯升高(P<0.05,P<0.01，圖1)。此外，MI組大鼠心肌組織Mb、CK-MB和cTn Ⅰ的表達(dá)水平均顯著高于Ctrl組(P<0.05，P<0.01，圖2)，TSⅡA(20、50、100)組大鼠Mb、CK-MB和cTn Ⅰ的蛋白表達(dá)水平與MI組比較均顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖2)，并隨濃度升高作用逐漸增強(qiáng)，表明TSⅡA能增強(qiáng)MI大鼠的心臟功能。

圖1 TSⅡA對MI大鼠MAP、HR和LVSP的影響Fig.1 Effects of TSⅡA on MAP,HR and LVSP of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

2.2TSⅡA對MI大鼠心肌損傷的影響 HE染色結(jié)果表明，正常組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)排列整齊，無水腫及充血；腦梗死后，MI組大鼠心肌纖維排列紊亂，并出現(xiàn)帶狀空泡化改變、細(xì)胞核固縮并伴有大量炎性物質(zhì)滲出(圖3)，同時(shí)心肌梗死面積顯著大于Ctrl組(P<0.01，圖4)；TSⅡA(20、50、100)組大鼠心肌組織病理損傷情況較MI組比較有所減輕，并隨濃度升高，損傷程度逐漸減輕(圖3)，同時(shí)心肌梗死面積也顯著低于MI組(P<0.05，P<0.01，圖4)；此外，MI還能顯著升高心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.01，圖5)，TSⅡA(20、50、100)能顯著降低MI模型大鼠心肌組織的細(xì)胞凋亡率(P<0.05，P<0.01，圖4)，表明TSⅡA 能減輕MI大鼠的心肌組織損傷，并具有量效關(guān)系。

圖2 TSⅡA對MI大鼠心肌組織Mb、CK-MB和cTnⅠ表達(dá)的影響Fig.2 Effect of TSⅡA on the expressions of Mb,CK-MB and cTnⅠNote: The protein levels of Mb,CK-MB and cTnⅠ were determined by western blot.GAPDH was used as loading control.**.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

圖3 TSⅡA對MI大鼠心肌病理損傷的影響Fig.3 Effect of TSⅡA on myocardial lesion of MI ratsNote: HE staining was performed for phathology injury of rats.

圖4 TSⅡA對MI大鼠心肌梗死面積的影響Fig.4 Effect of TSⅡA on myocardial infraction size of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

圖5 TSⅡA對MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of TSⅡA on myocardial cell apoptosis of MI ratsNote: Cell apoptosis was determined by Tunel assay.**.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus MI model group.

2.3TSⅡA對MI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激的影響 與Ctrl組比較，MI組大鼠血清SOD和GSH的濃度明顯降低，MDA濃度明顯升高(P<0.01，圖6)；與MI組比較，TSⅡA(20、50、100)組模型大鼠血清SOD和GSH含量顯著升高，MDA含量顯著降低，并具有劑量依賴性(P<0.05，P<0.01，圖6)，表明TSⅡA 能抑制MI大鼠心肌組織氧化應(yīng)激。

2.4TSⅡA對MI大鼠線粒體自噬的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心肌缺血能顯著升高大鼠心肌組織Beclin 1的表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，降低P62的蛋白表達(dá)水平(P<0.01，圖7)；TSⅡA(20、50、100)能顯著降低缺血誘導(dǎo)的MI模型大鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin 1的蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)P62表達(dá)(P<0.01，圖7)，并隨濃度的升高，對LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1和P62表達(dá)的調(diào)控作用逐漸增強(qiáng)，表明TSⅡA能抑制MI大鼠線粒體自噬。

圖6 TSⅡA對MI大鼠血清SOD、MDA和GSH濃度的影響Fig.6 Effect of TSⅡA on concentrations of SOD,MDA and GSH of MI ratsNote: **.P<0.01 versus Ctrl group;#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001 versus MI model group.

圖7 TSⅡA對MI大鼠心肌組織LC3、Beclin 1和P62表達(dá)的影響Fig.7 The effect of TSⅡA on expressions of LC3,Beclin 1 and P62 in myocardial tissues of MI ratsNote: GAPDH was used as loading control.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus MI model group.

3 討論

冠狀動脈阻塞是導(dǎo)致MI的主要原因。血流供應(yīng)的減少可導(dǎo)致心肌代謝紊亂，長時(shí)間的缺血缺氧可導(dǎo)致心肌功能的紊亂和心肌不可逆壞死，最終導(dǎo)致心衰。研究表明，心肌梗死面積與心臟功能呈正相關(guān)[11]。目前，大量臨床前研究發(fā)現(xiàn)多種藥物能縮小動物心肌梗死面積，但大多都在臨床試驗(yàn)時(shí)以失敗告終[9]。因此，急需尋找治療MI的新藥物。TSⅡA 是我國傳統(tǒng)中藥丹參的有效活性成分之一，主要提取自丹參的干燥根及根莖部位，丹參在我國已有上千年的用藥歷史，常被應(yīng)用于心血管疾病的治療[12]?，F(xiàn)代研究也表明TSⅡA具有明顯的心肌保護(hù)作用，能夠?qū)箘用}粥樣硬化、心肌缺血和心肌缺血再灌注損傷[11,13,14]。提示TSⅡA可能具有治療臨床MI的潛力。也有研究表明，TSⅡA能夠通過抑制心肌組織的炎癥反映增強(qiáng)MI大鼠的心臟功能[15]。本文研究結(jié)果表明，TSⅡA能顯著升高M(jìn)I模型大鼠的MAP、HR和LVSP，同時(shí)還能促進(jìn)心肌組織Mb、CK-MB和cTnⅠ的表達(dá)，表明TSⅡA能增強(qiáng)MI模型大鼠的心臟功能。此外，結(jié)扎冠狀動脈可導(dǎo)致大鼠心肌組織水腫、細(xì)胞排列紊亂及炎性細(xì)胞的浸潤，TSⅡA能顯著減輕MI模型大鼠心肌組織的損傷情況，縮小MI大鼠的心肌梗死面積，并隨濃度升高作用逐漸增強(qiáng)，TSⅡA還能抑制缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌梗死的主要原因，提示TSⅡA在增強(qiáng)MI模型大鼠心臟功能的同時(shí)還能減輕缺血導(dǎo)致的心肌損傷，進(jìn)一步表明TSⅡA具有較強(qiáng)的心血管保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致缺血后心臟功能紊亂及心肌細(xì)胞死亡的主要機(jī)制之一。缺血后大量氧自由基的產(chǎn)生誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，也可直接作用于心肌細(xì)胞膜內(nèi)的脂肪酸，誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞膜的滲透性[16]。脂質(zhì)過氧化物的積累可直接反映心肌的損傷程度。MDA是主要的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，MDA的過度積累又可進(jìn)一步誘導(dǎo)氧化自由基的產(chǎn)生，從而抑制抗氧化系統(tǒng)的激活，使損傷進(jìn)一步加重[17]。SOD是細(xì)胞抵抗氧化損傷的首要防線，能在清除活性氧化自由基的同時(shí)抑制羥自由基的產(chǎn)生[16]。大量研究表明，TSⅡA具有明確的抗氧化應(yīng)激活性，可減輕間歇性缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[18]。本文研究結(jié)果表明，MI模型大鼠血清SOD和抗氧化劑GSH濃度明顯低于健康大鼠，MDA濃度顯著升高，提示缺血缺氧可能誘導(dǎo)了心肌組織氧化應(yīng)激。TSⅡA能顯著降低MI大鼠血清中MDA的濃度，升高SOD和GSH濃度，表明TSⅡA能抑制心肌組織氧化應(yīng)激。

線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”，在多種病理情況下都發(fā)揮了重要作用[19]。研究表明，在缺血、缺氧及缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等應(yīng)激條件下，氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累可誘導(dǎo)線粒體自噬反應(yīng)，清除受損線粒體[20]。線粒體自噬與心肌缺血后心肌損傷密切相關(guān)[4]。缺血缺氧可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，從而導(dǎo)致活性氧及促凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步加重?fù)p傷，因此，早期通過自噬及時(shí)清除受損線粒體有利于減輕細(xì)胞損傷[21]。但在受損后期，過度自噬體則可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的死亡[22]。研究表明，TSⅡA能提供調(diào)控自噬減輕缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷，提示TSⅡA具有調(diào)控缺血后自噬的活性[23]。本文采用冠脈結(jié)扎法復(fù)制了大鼠MI模型，并探究了TSⅡA對MI 3周后大鼠線粒體自噬的影響。發(fā)現(xiàn)TSⅡA能顯著降低MI模型大鼠線粒體Beclin 1的表達(dá)水平和LC3Ⅱ/LCⅠ的比值，促進(jìn)線粒體P62的表達(dá)。其中，Beclin 1在自噬的起始階段發(fā)揮著重要作用，LC3則主要參與自噬小體的形成，能誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白的募集，P62主要參與溶酶體的降解表達(dá)水平與自噬呈負(fù)相關(guān)[24,25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSⅡA能抑制MI大鼠心肌線粒體自噬的發(fā)生。MI后3周已屬于MI的后期，結(jié)合前述文獻(xiàn)報(bào)道表明TSⅡA增強(qiáng)心臟功能、減輕心肌損傷的作用可能與抑制線粒體自噬有關(guān)。

綜上所述，TSⅡA能升高M(jìn)I模型大鼠MAP、HR和LVSP，抑制心肌組織Mb、CK-MB和cTnⅠ表達(dá)；同時(shí)，TSⅡA還能減輕模型大鼠心肌組織病理損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡、減少心肌梗死面積；此外，TSⅡA還能顯著抑制MDA分泌，升高血清SOD和GSH濃度，下調(diào)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin 1的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)線粒體P62的表達(dá)，表明TSⅡA能增強(qiáng)MI大鼠心臟功能、減輕心肌組織損傷和抑制心肌組織氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制可能與抑制線粒體自噬有關(guān)。本文首次探究了TSⅡA對MI后期的心肌保護(hù)作用與線粒體自噬的關(guān)系，可能為TSⅡA應(yīng)用于MI后期的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。