田雙蓮 漆楚波 朱潤清

(湖北省腫瘤醫(yī)院頭頸放療科，武漢430079)

頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是常見的原發(fā)于頭頸部口腔頜面部的人類惡性腫瘤之一，近些年對該病的手術(shù)、放、化療等綜合措施雖有很大提高，但有部分腫瘤特別是下咽癌5年的生存率仍然很低，給人類的生命健康造成嚴重威脅[1]。近些年通過分子靶向治療腫瘤成為熱點，在HNSCC中也發(fā)現(xiàn)多個靶點，但仍需要尋找更多有效的靶點[2,3]。賴氨酰氧化酶樣蛋白2(Lysyl oxidase-like 2，LOXL2) 基因定位于8p21.2-p21.3，是LOX家族的一個成員，是一類細胞外的修飾酶，生物學(xué)功能較廣泛。近些年的研究表明，LOXL2 與胃癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。胃癌中抑制LOXL2 表達可降低癌細胞增殖，胰腺癌細胞中抑制LOXL2 表達可降低細胞增殖及侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。LOXL2 對HNSCC生物學(xué)特性的影響及機制研究相對較少，有研究發(fā)現(xiàn)LOXL2在HNSCC中高表達，高表達患者易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，且預(yù)后差，抑制LOXL2表達可降低HNSCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[5]，但對其凋亡及機制研究的尚未明確。PD-L1是一種重要的負性協(xié)同刺激分子，可介導(dǎo)腫瘤發(fā)生免疫逃逸[6]。LOXL2是否可影響PD-L1而對HNSCC免疫產(chǎn)生影響也尚未清楚。因此，本研究旨在抑制LOXL2表達對HNSCC細胞凋亡及PD-L1表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 LipofectamineTM2000、RPMI1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Invitrogen；LOXL2、PD-L1、STAT3、p-STAT3、PCNA和Bax抗體均購自美國CST；BCA試劑盒購自上海碧云天；CCK8購自日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD；酶標儀購自美國Bio-TEK，人HNSCC細胞YCU-H891(下咽鱗癌細胞)、YCU-N861(鼻咽鱗癌細胞)和KB(口腔鱗癌細胞)細胞均購自美國ATCC。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞常規(guī)復(fù)蘇后，YCU-H891和YCU-N861細胞用RPMI1640培養(yǎng)液，KB細胞用MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中均含有10%胎牛血清及青、鏈霉素雙抗，于5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，細胞為單層貼壁生長。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.2.2Western blot 適量裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定，蛋白煮沸變性5 min，取變性蛋白等量(40 μg)，經(jīng)10%的SDS-PAGE，蛋白分離后電轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%的脫脂奶粉將已轉(zhuǎn)好的PVDF膜封閉1 h，洗膜，加入一抗稀釋液(1∶1 000稀釋的LOXL2 、PD-L1、STAT3、p-STAT3、PCNA和Bax抗體)，4℃平緩搖動過夜，洗膜，室溫加入二抗稀釋液(1∶2 000稀釋的HRP標記的抗體)孵育1 h，洗膜，經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光攝片。以GAPDH為內(nèi)參，以LOXL2 、PD-L1、STAT3、p-STAT3、PCNA和Bax與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.2.3siRNA轉(zhuǎn)染 根據(jù)NCBI GenBank中提供的人LOXL2 的mRNA序列，遵循siRNA的設(shè)計原則，設(shè)計LOXL2的siRNA及無關(guān)對照序列，分別標記為si-LOXL2組和NC組，siRNA序列如下(均列出正義鏈)：si-LOXL2：5′-GAAGGAGACAUCCAGAAGATT-3′，NC組：5′-CCCUUCUCUGUUUGUAAAGAGACAU-3′。按照LipofectamineTM2000說明制備siRNA-Lip2000混合物，經(jīng)過優(yōu)化實驗，選擇40 pmol/L的siRNA為轉(zhuǎn)染濃度。轉(zhuǎn)染前1 d以1×105個/孔細胞接種生長至對數(shù)期的KB細胞于6孔板，細胞達70%生長融合時，將siRNA轉(zhuǎn)染細胞，并設(shè)置空白對照組，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5～6 h，更換為不含抗生素的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于實驗研究。

1.2.4CCK8法檢測細胞活力 胰酶消化、重懸生長至對數(shù)期的KB細胞，以每孔5 000個細胞接種于96孔板，每孔加入100 μl，培養(yǎng)24 h后，參照1.2.3方法轉(zhuǎn)染siRNA，每組設(shè)置5個復(fù)孔，于轉(zhuǎn)染的48 h加CCK8溶液，每孔中加入10 μl，37℃孵育2 h，酶標儀檢測吸光度值(A值，450 nm)。實驗重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將生長至對數(shù)期的KB細胞制備成為單細胞懸液，以2×105孔-1接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)染siRNA，于轉(zhuǎn)染后的48 h收集細胞，預(yù)冷的PBS洗滌細胞，結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入AnnexinV-FITC和PI各5 μl，4℃避光放置10～15 min，加入400 μl結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測。分析各組細胞的凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1LOXL2 在HNSCC細胞表達 以Western blot檢測人HNSCC細胞YCU-H891、YCU-N861和KB中LOXL2 的蛋白表達，結(jié)果如圖1所示，三個細胞中LOXL2 的蛋白表達分別為0.273±0.032、0.345±0.038、0.659±0.056，LOXL2 在KB細胞中的表達最高，選擇作為研究對象。

2.2LOXL2 siRNA轉(zhuǎn)染KB細胞的效果 LOXL2 siRNA轉(zhuǎn)染KB細胞48 h，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞中LOXL2的蛋白表達，結(jié)果如圖2和表1所示，轉(zhuǎn)染LOXL2 siRNA的KB細胞LOXL2的蛋白表達顯著低于空白組(P<0.05)，而在NC組中的表達與空白組無明顯差異(P>0.05)，這提示抑制LOXL2表達的KB細胞建立成功。

圖1 LOXL2 在HNSCC細胞表達Fig.1 LOXL2 expression in HNSCC cells

2.3LOXL2 siRNA對KB細胞活力及凋亡率的影響 各組細胞活力及凋亡率檢測結(jié)果如圖3和表2所示，與NC組比較，si-LOXL2 組細胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 LOXL2 siRNA轉(zhuǎn)染KB細胞的效果Fig.2 Effect of LOXL2 siRNA transfection on KB cells

表1LOXL2siRNA轉(zhuǎn)染KB細胞后效果

Tab.1EffectofLOXL2siRNAtransfectiononKBcells

GroupsRelative expression of protein in KBBlank group0.502±0.043NC group0.526±0.047si-LOXL2 group0.087±0.0101)F131.862P0.000

Note：1)P<0.05 vs blank group.

圖3 LOXL2 siRNA對KB細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of LOXL2 siRNA on apoptosis rate of KB cells

表2LOXL2siRNA對KB細胞活力及凋亡率的影響

Tab.2EffectofLOXL2siRNAonapoptosisrateofKBcells

GroupsA valueApoptosis rate(%)Blank group0.794±0.0651.96±0.31NC group0.773±0.0602.08±0.37si-LOXL2 group0.452±0.0461)18.17±0.791)F33.263912.962P0.0010.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

2.4LOXL2 siRNA對KB細胞免疫逃逸相關(guān)基因PD-L1表達的影響 各組細胞PD-L1的蛋白表達結(jié)果如圖4和表3所示，與NC組比較，si-LOXL2組PD-L1的蛋白表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5LOXL2 siRNA對KB細胞STAT3信號通路的影響 各組細胞中STAT3、p-STAT3及STAT3信號通路下游增殖相關(guān)蛋白PCNA及凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達結(jié)果如圖5和表4所示，與NC組比較，si-LOXL2 組p-STAT3和PCNA蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。三組細胞中STAT3的蛋白表達差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 LOXL2 siRNA對KB細胞PD-L1表達的影響Fig.4 Effect of LOXL2 siRNA on expression of PD-L1 in KB cells

表3LOXL2siRNA對KB細胞PD-L1表達的影響

Tab.3EffectofLOXL2siRNAonexpressionofPD-L1inKBcells

GroupsRelative expression of protein in KBBlank group0.489±0.054NC group0.472±0.051si-LOXL2 group0.125±0.0141)F66.478P0.000

Note：1)P<0.05 vs NC group.

圖5 LOXL2 siRNA對KB細胞STAT3信號通路的影響Fig.5 Effect of LOXL2 siRNA on STAT3 signaling pathway in KB cells

表4LOXL2siRNA對KB細胞STAT3信號通路的影響

Tab.4EffectofLOXL2siRNAonSTAT3signalingpathwayinKBcells

GroupsSTAT3p-STAT3PCNABaxBlank group0.754±0.0670.201±0.0230.315±0.0340.125±0.015NC group0.736±0.0620.189±0.0190.327±0.0370.112±0.013si-LOXL2 group0.719±0.0600.102±0.0111)0.166±0.0201)0.206±0.0241)F0.23125.98524.75224.071P0.8010.0010.0010.001

Note：1)P<0.05 vs NC group.

3 討論

LOX是一類細胞外基質(zhì)修飾酶，LOXL、LOXL2、LOXL3和LOXL4是4個與LOX結(jié)構(gòu)同源和相似的酶，統(tǒng)稱為LOX家族。LOXL2是LOX家族成員之一，在胎盤組織、子宮、前列腺中高表達，而在腎、心、肺等組織中呈現(xiàn)出低表達[7]。近些年研究發(fā)現(xiàn)LOXL2與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如LOXL2的高表達與乳腺腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]；在HNSCC、食管癌中LOXL2的高表達不僅與惡性表型有關(guān)，還可對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移起促進作用[9,10]，這提示LOXL2影響HNSCC的發(fā)生發(fā)展。RNAi是一項基因功能研究的新技術(shù)，可在轉(zhuǎn)染后表達沉默基因，阻斷基因表達具有高效性、高穩(wěn)定性和高特異性的特點[11,12]。有研究表明，通過RNAi技術(shù)抑制LOXL2表達可通過降低CD44、MMP-9表達介導(dǎo)膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]，通過RNAi技術(shù)抑制LOXL2表達可降低HNSCC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[5]。本研究旨在通過RNAi抑制LOXL2表達對HNSCC細胞凋亡及機制研究。通過Western blot分別檢測下咽鱗癌細胞YCU-H891、鼻咽鱗癌細胞YCU-N861及口腔鱗癌細胞KB中LOXL2的表達，發(fā)現(xiàn)LOXL2在KB細胞中的表達最高，因此選擇作為研究對象。將合成的LOXL2的siRNA轉(zhuǎn)染KB細胞，發(fā)現(xiàn)LOXL2表達受到抑制后KB細胞活力明顯降低，凋亡率增加，這提示抑制LOXL2表達可誘導(dǎo)HNSCC細胞凋亡。

STAT3是JAK/STATs信號通路重要成員之一，是一種具有致癌功能的轉(zhuǎn)錄因子，可被多種配體激活，如IL-6、IL-10等細胞因子等，EGF、HGF等生長因子類[14]。在多種腫瘤中出現(xiàn)過度激活，如HNSCC、白血病等[15,16]，STAT3并不直接引起腫瘤的發(fā)生，而是通過誘導(dǎo)凋亡抑制因子、細胞周期調(diào)整因子等高表達，促進細胞增殖和抑制凋亡從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，從而抑制STAT3信號通路可降低腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。PCNA是DNA復(fù)制過程中的必需物質(zhì)，與細胞增殖密切相關(guān)，已作為檢測腫瘤細胞增殖活性的指標[18]。Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，其表達升高可對腫瘤細胞凋亡起促進作用[19]。PD-L1是CD28-B7受體家族的一個成員，主要在腫瘤細胞膜表面、NK細胞、B細胞和T細胞表達。在包括口腔鱗狀細胞癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有表達，其表達可介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸[20]。而有研究指出，抑制其表達可逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫抑制，達到抗腫瘤目的[21]。抑制STAT3信號通路可下調(diào)肺癌細胞PD-L1表達[22]。本研究中檢測PD-L1、STAT3、p-STAT3、PCNA和Bax的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)LOXL2表達受到抑制后p-STAT3、PCNA和PD-L1表達明顯降低，Bax表達升高，這提示LOXL2可通過下調(diào)STAT3信號抑制HNSCC細胞生長及介導(dǎo)免疫逃逸。

綜上所述，LOXL2在HNSCC細胞表達升高，抑制其表達可降低癌細胞活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，降低免疫逃逸，機制可能與下調(diào)STAT3信號通路有關(guān)。本研究提示LOXL2可能是HNSCC治療的一個有效的分子靶點。