朱琳琳 賀曉丹 徐祉軒

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南省分子檢驗(yàn)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453003)

滋養(yǎng)細(xì)胞屬于胎盤組織細(xì)胞，有類似腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，具有較高的增殖和遷移能力，對(duì)于維持正常妊娠過(guò)程具有重要作用，滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致子癇前期(Preeclampsia，PE)的發(fā)生。PE是妊娠期特有的以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的疾病，發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害母嬰健康。高遷移率簇蛋白B1(High mobility group box-1，HMGB1)作為重要的炎性因子，胎盤中也有表達(dá)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中適度表達(dá)可以促進(jìn)其遷移，利于胎盤的生長(zhǎng)，但高表達(dá)則引起胎盤炎癥反應(yīng)，引發(fā)子癇前期[1]。若能調(diào)控HMGB1的表達(dá)，對(duì)子癇前期的防治具有重要意義。藍(lán)萼甲素(Glaucocalyxin A，GLA)是從香茶菜中分離提取的二萜化合物，具有良好的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用[2-7]，但對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的作用尚不明確。本研究檢測(cè)GLA對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響，試圖探討GLA在滋養(yǎng)細(xì)胞中的抗炎機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)作用，為GLA的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，熒光質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)中心保存。胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；GLA由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供；轉(zhuǎn)染試劑TfxTM-50 Reagent購(gòu)自Promega公司；Trizol試劑、Taq酶、DNA Marker Ⅲ、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京天根公司；反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)購(gòu)自TaKaRa公司；所用引物均為上海英駿生物公司合成；兔抗人HMGB1抗體、β-actin、熒光標(biāo)記二抗購(gòu)自Abcam公司，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、0.01、0.1、1、10 μg/ml GLA組，空白對(duì)照組不加任何處理因素，其他各組分別加入相應(yīng)濃度的GLA進(jìn)行刺激，5組細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖 配制WST-1 溶液，將5組細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔體積100 μl，約2 000個(gè)細(xì)胞，各孔分別加入10 μl WST-1 溶液，96 孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出96 孔板，搖床上搖動(dòng)1 min，充分混勻待檢測(cè)體系，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定各孔標(biāo)本吸光度。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)HMGB1的表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)HMGB1、GAPDH的mRNA 的表達(dá)。HMGB1引物序列為 F：TGAGCTCCATAGAGACAGCG，R：GCAGACATGGTCTTCCAC-CT，產(chǎn)物長(zhǎng)度248 bp，退火60℃；GAPDH引物序列為F：GAGAAGGCTGGGGCTCATTT，R：GGACTGTGGTCATGAGTCCT，產(chǎn)物長(zhǎng)度220 bp，退火60℃。

1.2.4Western blot檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)HMGB1、β-actin的蛋白表達(dá)情況，以目的片段條帶灰度值與GAPDH 灰度值的比值，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入1.5 ml 無(wú)菌EP管，800 r/min離心5min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次后每管加入200 μl細(xì)胞裂解液，振蕩30 s，室溫放置5 min，12 000 r/min離心30 s，取20 μl上清液加入100 μl熒光素酶反應(yīng)底物，混合后用熒光分析儀檢測(cè)各管標(biāo)本產(chǎn)生熒光的光量值。

1.2.6HMGB1-EGFP熒光融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以JAR細(xì)胞的cDNA為模板，擴(kuò)增HMGB1基因全長(zhǎng)，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增HMGB1，所用引物序列為F：GGCAAGCTTTTCA-TCATCATCATCTTC，R：GAAGATCTATGGGCAAAG-GAGATCCTAA。Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切后純化的HMGB1片段與pFLAG-cmv2雙酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性菌落增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定測(cè)序，構(gòu)建方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。

1.2.7激光共聚焦檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組與0.1 μg/ml GLA組，采用爬片的方法在24孔板中培養(yǎng)JAR細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，將0.5 μg pHMGB1-EGFP轉(zhuǎn)染入兩組JAR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后，0.1 μg/ml GLA組加入終濃度為0.1 μg/ml 的GLA，兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后DAPI染色，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞中的分布情況。

1.2.8GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組與0.1 μg/ml GLA組，6孔板中培養(yǎng)JAR細(xì)胞，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，0.1 μg/ml GLA組加入終濃度為0.1 μg/ml的GLA，對(duì)照組不加任何處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸取上清培養(yǎng)液于1.5 ml EP管中，采用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)液中HMGB1的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1GLA對(duì)JAR細(xì)胞增殖的影響 本研究主要探討GLA調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞HMGB1表達(dá)的機(jī)制，為避免GLA通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞增殖進(jìn)而影響其HMGB1的表達(dá)，故采用低劑量GLA，分別在培養(yǎng)12、24、36、48 h 時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.01、0.1、1、10 μg/ml GLA對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA的表達(dá) 0.01 μg/ml與0.1 μg/ml GLA對(duì)HMGB1表達(dá)有促進(jìn)作用，其中0.1 μg/ml GLA的促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.01)。隨著濃度的增加，GLA表現(xiàn)出抑制作用，10 μg/ml GLA的抑制作用最為顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖2，GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)的作用呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

圖1 滋養(yǎng)細(xì)胞增殖曲線Fig.1 Proliferation curve of trophoblast cells

圖2 GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA的表達(dá)Fig.2 GLA regulate HMGB1 mRNA expression in JAR cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01,vs 0 μg/ml GLA group(control group).

圖3 GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞HMGB1蛋白的表達(dá)Fig.3 GLA regulate HMGB1 protein expression in JAR cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01,vs 0 μg/ml GLA group(control group).

2.3GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞HMGB1蛋白的表達(dá) 與RNA結(jié)果一致，0.01 μg/ml、0.1 μg/ml GLA對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用(P<0.05)，其中0.1 μg/ml GLA的促進(jìn)作用最強(qiáng)，1 μg/ml GLA則有明顯抑制作用(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4GLA調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)活性 GLA對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1蛋白水平表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，0.1 μg/ml GLA能夠顯著刺激JAR細(xì)胞NF-κB表達(dá)，使其活性增強(qiáng)。隨著GLA濃度逐漸升高，至1 μg/ml時(shí)，熒光素酶活性反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)GLA濃度達(dá)到10 μg/ml時(shí)，細(xì)胞中熒光素酶活性降低最為顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖4。GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞NF-κB活性也呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，與其調(diào)節(jié)HMGB1蛋白的表達(dá)作用效果雖略有不同但趨勢(shì)一致。

2.5GLA調(diào)節(jié)HMGB1的細(xì)胞內(nèi)分布 應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)分別檢測(cè)兩組細(xì)胞中HMGB1表達(dá)分布情況。結(jié)果表明，對(duì)照組：HMGB1主要存在于細(xì)胞核中；0.1 μg/ml GLA組：由于GLA的刺激作用，HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖5。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了JAR細(xì)胞受到刺激以后，HMGB1呈現(xiàn)高表達(dá)，且出現(xiàn)核漿轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，進(jìn)而有可能以自分泌和(或)旁分泌的方式釋放出細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

圖4 GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞NF-κB的表達(dá)活性Fig.4 GLA regulate NF-κB activity in JAR cellsNote: *.P<0.05，**.P<0.01,vs 0 μg/ml GLA group(control group).

圖5 GLA調(diào)節(jié)HMGB1在JAR細(xì)胞內(nèi)的分布(×400)Fig.5 GLA regulate HMGB1 distribution in JAR cells(×400)

2.6GLA調(diào)節(jié)JAR細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1的表達(dá) 為探討HMGB1 能否以自分泌和(或)旁分泌的方式作用于自身細(xì)胞和(或)其他細(xì)胞，本研究利用ELISA法檢測(cè)對(duì)照組與0.1 μg/ml GLA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1的表達(dá)量。結(jié)果表明，0.1 μg/ml GLA組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度為(9.11±0.50) ng/ml，而對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1濃度為(7.14±0.42) ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

香茶菜在我國(guó)民間作為中草藥用于抗菌消炎已有悠久的歷史，其功效的發(fā)揮主要依靠代謝產(chǎn)生的活性成分，即二萜化合物，GLA就是從藍(lán)萼香茶菜中提取的二萜化合物的典型代表[9,10]。研究表明，GLA 具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物所引起的肝線粒體腫脹，影響淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)[11-14]。HMGB1是典型的炎性因子，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低血清中HMGB1 濃度，減少TLR4 蛋白表達(dá)，可以抑制NF-κB通路的激活，減輕炎癥反應(yīng)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)0.01 μg/ml和0.1 μg/ml GLA可以顯著促進(jìn)HMGB1 mRNA與蛋白表達(dá)，尤以0.1 μg/ml GLA的促進(jìn)作用最強(qiáng)。但隨著GLA濃度的增高，10 μg/ml GLA則顯示出明顯的抑制作用，表明GLA對(duì)JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA與蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)。為了排除GLA抑制滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)HMGB1是由于其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的毒性作用所引起，我們利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示5組細(xì)胞之間，小劑量的GLA對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著差異。進(jìn)一步利用激光共聚焦技術(shù)，我們還發(fā)現(xiàn)無(wú)外因刺激時(shí)，JAR細(xì)胞中HMGB1主要表達(dá)于細(xì)胞核；GLA刺激后，HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入細(xì)胞質(zhì)。表明GLA能夠刺激滋養(yǎng)細(xì)胞中HMGB1的核漿轉(zhuǎn)移。ELISA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1可被滋養(yǎng)細(xì)胞分泌釋放。相一致的是，之前有研究發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞能夠主動(dòng)分泌HMGB1，細(xì)胞外HMGB1可與RAGE、TLR2和TLR4等受體結(jié)合，誘導(dǎo)NF-κB等多種炎性因子的表達(dá)[16,17]。

NF-κB是機(jī)體炎癥反應(yīng)的核心因子，研究表明GLA能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[18]，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，GLA調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)活性具有劑量依賴效應(yīng)，0.01 μg/ml和0.1 μg/ml GLA能夠刺激JAR細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，隨著濃度的增加，1 μg/ml與10 μg/ml GLA表現(xiàn)出抑制作用，與其調(diào)節(jié)HMGB1 mRNA與蛋白表達(dá)的作用趨勢(shì)一致，因此，我們推測(cè)GLA調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制很有可能是通過(guò)HMGB1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

我們前期研究結(jié)果顯示：重度子癇前期患者胎盤中HMGB1 mRNA與蛋白的表達(dá)水平明顯升高，且表現(xiàn)出核漿轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[1]。本研究通過(guò)激光共聚焦和ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了這一點(diǎn)，說(shuō)明滋養(yǎng)細(xì)胞受到外因刺激后可以合成并釋放HMGB1，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。綜合這些結(jié)果，我們推測(cè)HMGB1的核漿轉(zhuǎn)移參與誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的過(guò)程，而這一點(diǎn)也很有可能是其參與子癇前期發(fā)病的機(jī)制之一。

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞有類似腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，具有較高的增殖和遷移能力。HMGB1在正常妊娠者胎盤及外周血中適度表達(dá)，能夠協(xié)助滋養(yǎng)細(xì)胞的正常增殖、遷移，促進(jìn)胎盤的正常發(fā)育及母胎之間的適度免疫應(yīng)答；但作為炎性細(xì)胞因子，HMGB1過(guò)表達(dá)會(huì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮缺血缺氧、滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常、胎盤發(fā)育不良，誘發(fā)子癇前期。子癇前期患者胎盤中往往存在細(xì)胞凋亡與壞死。凋亡、壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放HMGB1，加上氧化應(yīng)激與炎性因子的刺激，滋養(yǎng)細(xì)胞主動(dòng)合成釋放HMGB1，都會(huì)導(dǎo)致胎盤組織中HMGB1 表達(dá)升高，這些高表達(dá)的HMGB1一方面發(fā)揮代償作用，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡；但另一方面過(guò)多的HMGB1又會(huì)引起胎盤局部及母體全身過(guò)度性炎癥反應(yīng)，加重病情，造成不良結(jié)局。

因而，采取一定措施將HMGB1的表達(dá)控制在合適區(qū)間，既能保護(hù)其發(fā)揮有利作用，又能抑制其產(chǎn)生不良影響，對(duì)子癇前期的防治有新的意義和價(jià)值。在后續(xù)的研究中，我們可以HMGB1 為靶點(diǎn)進(jìn)一步深入探討GLA通過(guò)HMGB1信號(hào)通路調(diào)節(jié)組織炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為GLA的臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。