應(yīng)亞宸，張廣杰*，賈薈琳，陸政元，石玉潔，席 鵬

(1.北京大學(xué) 工學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程系，北京 100871；2．北京大學(xué) 元培學(xué)院，北京 100871)

1 引 言

組織成像能為組織病理診斷提供直觀(guān)的依據(jù)，在醫(yī)學(xué)病理檢查中有著重要的地位。傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)病理檢測(cè)通常需要切取一定大小的病變組織，其制作病理切片，最后用顯微鏡進(jìn)一步檢測(cè)病變組織，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，并且會(huì)為患者帶來(lái)額外的痛苦。近幾十年來(lái)，有大量的研究者致力于開(kāi)發(fā)新型組織成像技術(shù)，活體光學(xué)成像由于具有無(wú)創(chuàng)性、成像實(shí)時(shí)性、可對(duì)統(tǒng)一組織區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)[1]，成為研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)在常見(jiàn)的組織光學(xué)成像技術(shù)有熒光成像、光聲成像[2]、光學(xué)相干層析成像(OCT)[3]等。

1990年，Winfried Denk[4]等人創(chuàng)造性地提出了雙光子熒光顯微的概念，繼而發(fā)展出多光子熒光成像技術(shù)，為活體組織光學(xué)成像提供了新的思路。相較于傳統(tǒng)的單光子共聚焦熒光成像技術(shù)，多光子熒光成像具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，在組織中的散射系數(shù)較小，具有很好的組織穿透性，能夠探測(cè)到更深的組織結(jié)構(gòu)；(2)多光子成像的聚焦性好，焦平面外的熒光分子幾乎不被激發(fā)；(3)多光子技術(shù)的激發(fā)光光子能量更低，細(xì)胞毒性小，對(duì)組織的損傷更少，具有很好的安全性[1]。因此，多光子技術(shù)在活體組織成像，尤其是皮膚組織的成像中得到了廣泛的使用。近年來(lái)，該技術(shù)也取得了產(chǎn)業(yè)化的成果：JenLab[5]已經(jīng)推出基于多光子層析成像的皮膚檢測(cè)系統(tǒng)，在早期皮膚癌癥診斷、皮膚衰老檢測(cè)等方面均有著應(yīng)用。本文將介紹多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)的主要技術(shù)原理，以及其在皮膚組織病理性檢測(cè)中的一些應(yīng)用，并簡(jiǎn)要探討這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

2 多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)成

多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)基于雙光子自發(fā)熒光、二次諧波成像、熒光壽命成像等技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)皮膚組織結(jié)構(gòu)與功能上的成像[6]。同時(shí)，相干反斯托克斯-拉曼散射光譜成像技術(shù)也被應(yīng)用到該檢測(cè)系統(tǒng)中，以實(shí)現(xiàn)皮膚組織中非熒光物質(zhì)(如脂質(zhì))的成像[7]。

2.1 雙光子自發(fā)熒光

雙光子自發(fā)熒光指基態(tài)熒光分子或原子吸收兩個(gè)光子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后恢復(fù)到基態(tài)并發(fā)出熒光的過(guò)程。熒光分子在吸收第一個(gè)光子后，將躍遷至一個(gè)虛態(tài)，需要第二個(gè)光子在幾飛秒內(nèi)與處于虛態(tài)的熒光分子作用，熒光分子才能從虛態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)[4]。

圖1 主要內(nèi)源熒光分子的(a)激發(fā)光譜；(b)發(fā)射光譜[10] Fig.1 (a)Excitation spectra; (b)emission spectra of primary endogenous fluorophores[10]

自發(fā)熒光物質(zhì)是指生物細(xì)胞與組織內(nèi)固有的熒光物質(zhì)。當(dāng)被合適波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，一些細(xì)胞和組織的內(nèi)容物能夠發(fā)出穩(wěn)定的熒光信號(hào)，它們也因此被稱(chēng)為內(nèi)源熒光團(tuán)[8]。一些內(nèi)源熒光團(tuán)分子(圖1)廣泛分布于細(xì)胞和組織之中，例如NAD(P)H、卟啉類(lèi)化合物、黃素、黑色素等。皮膚組織中NAD(P)H的含量與皮膚組織細(xì)胞內(nèi)氧化還原與新陳代謝水平相關(guān)，可作為皮膚衰老檢測(cè)的分子標(biāo)志物[9]；皮膚黑色素瘤會(huì)使黑色素細(xì)胞的形態(tài)與邊界發(fā)生變化。因此，可以用多光子無(wú)標(biāo)記成像實(shí)現(xiàn)對(duì)于皮膚疾病的早期探測(cè)以及對(duì)皮膚衰老的檢測(cè)。

在多光子皮膚檢測(cè)中，用于成像的主要內(nèi)源熒光團(tuán)有角質(zhì)層中的角質(zhì)蛋白、顆粒層中的NAD(P)H、基底層中的黑色素、真皮層中的膠原蛋白與彈性蛋白等。由于多光子技術(shù)具有很好的共聚焦效應(yīng)，使用該技術(shù)可以獲得不同深度的皮膚組織自發(fā)熒光成像(圖2)。上述熒光團(tuán)的單光子激發(fā)光波長(zhǎng)大多位于紫外光波段(340～400 nm)，會(huì)對(duì)皮膚組織造成很大的損傷；而使用雙光子激發(fā)則只需近紅外光(700～850 nm)，光子能量較低，大大減小了對(duì)活體組織的傷害[11]，也降低了光漂白對(duì)熒光成像的影響。同時(shí)，自發(fā)熒光成像技術(shù)使得皮膚組織在成像時(shí)不需要外源熒光團(tuán)的標(biāo)記，在臨床應(yīng)用上更加方便、安全。

圖2 健康人體皮膚活體成像，激發(fā)光波長(zhǎng)760 nm：(a)角質(zhì)層，0 μm深：角蛋白自發(fā)熒光信號(hào)；(b)顆粒層，20 μm深：角質(zhì)細(xì)胞中的透明角質(zhì)顆粒、NADPH、角蛋白自發(fā)熒光信號(hào)；(c)棘層，30 μm深：角質(zhì)細(xì)胞密度增大；激發(fā)光波長(zhǎng)800 nm; (d)真皮層，85 μm深：膠原蛋白、彈性蛋白自發(fā)熒光信號(hào)[11] Fig.2 In vivo healthy human skin imaging with excitation wavelength of 760 nm:(a)Stratum corneum, 0 μm depth: auto-fluorescence signal of keratin; (b)Stratum granulosum, 20 μm depth: auto-fluorescence signal of keratohyalin granules, NADPH, and keratin in keratinocytes; (c)Stratum spinosum, 30 μm depth: increased cellular density of keratinocytes; 800 nm excitation wavelength: (d)Dermis, 85 μm depth: auto-fluorescence signal of collagen and elastin[11]

圖3 (a)雙光子激發(fā)熒光(2PEF)和(b)二次諧波成像(SHG)的Jablonski圖[12] Fig.3 Jablonski image of (a)two-photon excitation fluorescence(2PEF) and (b)second harmonic generation(SHG)[12]

2.2 二次諧波成像

二次諧波成像是一種非線(xiàn)性的光學(xué)過(guò)程，在此過(guò)程中，兩個(gè)相同頻率光子與非對(duì)稱(chēng)介質(zhì)發(fā)生相互作用，將其從基態(tài)激發(fā)至虛態(tài)。在從虛態(tài)恢復(fù)到基態(tài)的過(guò)程中，釋放頻率增倍、波長(zhǎng)減半的光子(圖3)。由于其可將物質(zhì)自發(fā)激發(fā)至虛態(tài)的特性，二次諧波成像不需要熒光標(biāo)記，因此不會(huì)受到光漂白或光毒性的影響。與雙光子熒光激發(fā)不同的是，二次諧波成像中，被激發(fā)物體吸收的能量和放出的能量大小相同，因此，若對(duì)同一物質(zhì)進(jìn)行雙光子熒光成像與二次諧波成像，所得的成像信號(hào)會(huì)出現(xiàn)在不同的頻率范圍。

圖4 真皮層中膠原蛋白纖維的SHG信號(hào)(藍(lán))與彈性蛋白纖維的自發(fā)熒光信號(hào)(綠)[14] Fig.4 SHG signal of collagen fibers(blue) and autofluorescence signal of elastic fibers(green) in the dermis(Scale bar:20 μm)[14]

在生物體中，SHG成像多發(fā)生在細(xì)胞的非對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)上，如膠原蛋白、微管蛋白等。在皮膚活體成像中，SHG成像也有著重要的應(yīng)用。通常使用波長(zhǎng)為800 nm左右的激發(fā)光，對(duì)如真皮層中的膠原蛋白和彈性蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行成像[4]。如圖4所示，綠色熒光信號(hào)是真皮層中彈性蛋白的自發(fā)熒光信號(hào)，藍(lán)色熒光信號(hào)是膠原蛋白纖維的SHG信號(hào)。與自發(fā)熒光相同的是，這些蛋白的微結(jié)構(gòu)與皮膚疾病的發(fā)展密切相關(guān)，有研究表明，在皮膚表淺性基底細(xì)胞癌中，膠原蛋白纖維的排布狀態(tài)與正常皮膚不同[13]。因此SHG提供了另外一種監(jiān)測(cè)疾病的成像模態(tài)。

2.3 熒光壽命成像

熒光壽命指分子受光脈沖激發(fā)后返回基態(tài)之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間，即激發(fā)停止后，分子的熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)最大強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間。由于多光子成像需要采用脈沖飛秒激光器，因此特別適合于提取熒光壽命信號(hào)。熒光壽命與熒光的初始強(qiáng)度無(wú)關(guān)，而和熒光分子所處的微環(huán)境有關(guān)。熒光壽命通常使用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)技術(shù)來(lái)測(cè)量，可以達(dá)到皮秒級(jí)的分辨率[1]。熒光壽命成像就是將不同熒光壽命進(jìn)行可視化區(qū)別的技術(shù)。由于熒光壽命和熒光分子所處的微環(huán)境條件、與蛋白的結(jié)合、輔酶的代謝能力等一系列組織生理因素有關(guān)，熒光壽命成像技術(shù)為組織生理情況的檢測(cè)(如是否可能患有癌癥)提供了可能[15]。例如，Yuri Dancik[16]等人結(jié)合多光子斷層成像與熒光壽命等技術(shù)，對(duì)亞洲與非洲人種的皮膚顆粒層與基底層進(jìn)行成像(圖5)，發(fā)現(xiàn)亞洲人種皮膚顆粒層的分子熒光壽命顯著高于基底層以及非洲人種，研究者此后也分析了色素含量與熒光壽命以及熒光強(qiáng)度的相關(guān)性，并由此計(jì)算出了亞洲人種與非洲人種不同皮膚組織深度中黑色素含量的關(guān)系，即非洲人皮膚中的黑色度含量約為亞洲人的4～5倍。

圖5 不同深度皮膚組織自發(fā)熒光強(qiáng)度影像與熒光壽命影像對(duì)比. 亞洲志愿者的：(a)顆粒層、(b)基底層；非洲志愿者的：(c)顆粒層、(d)基底層[16] Fig.5 Contrast of auto-fluorescence intensity maps and lifetime color maps:Asian volunteer′s (a)stratum granulosum; (b)stratum basal; African volunteer′s (c)stratum granulosum; (d)stratum basal[16]

2.4 相干反斯托克斯-拉曼散射成像

前面提到的雙光子自發(fā)熒光技術(shù)、二次諧波成像技術(shù)和熒光壽命成像技術(shù)在對(duì)某些非熒光物質(zhì)，如脂質(zhì)等的成像中存在一定的限制?；诶⑸涞某上窦夹g(shù)能夠提供這些非熒光物質(zhì)的信息，并且具有很好的分子識(shí)別度[7]。

相干反斯托克斯-拉曼成像是一個(gè)三階非線(xiàn)性光學(xué)過(guò)程，需要抽運(yùn)激光束、斯托克斯激光束以及探測(cè)激光束等3種激光束與同一樣品發(fā)生作用，最后產(chǎn)生相干光學(xué)信號(hào)(圖6)。由于共振激發(fā)作用，相干反斯托克斯-拉曼(CARS)能夠比線(xiàn)性拉曼過(guò)程提供更強(qiáng)的信號(hào)[7]；同時(shí)，CARS信號(hào)波長(zhǎng)相對(duì)激發(fā)光有明顯藍(lán)移，因此，這項(xiàng)技術(shù)具有高峰值、高靈敏度的特點(diǎn)。CARS已經(jīng)應(yīng)用于皮膚活體成像系統(tǒng)中，主要提供皮膚組織中脂質(zhì)分布的成像(圖7)。鱗狀細(xì)胞癌(SCC)能夠使皮膚細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，在CARS成像中無(wú)法觀(guān)察到清晰的細(xì)胞邊界，與正常的皮膚組織成像存在區(qū)別，因此CARS成像可作為SCC的一種輔助診斷方式[17]。

圖6 相干反斯托克斯-拉曼(CARS)的Jablonski圖:(a)拉曼散射; (b)受激拉曼散射; (c)相干反斯托克斯-拉曼 Fig.6 Jablonski image of coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS):(a)Raman Scattering; (b)Stimulated Raman Scattering; (c)Coherent Anti-Stokes Raman Scattering

圖7 健康人體皮膚活體成像:(a)CARS成像信號(hào); (b)雙光子激發(fā)熒光/SHG成像信號(hào); (c)CARS-雙光子激發(fā)熒光/SHG成像信號(hào)疊加[7] Fig.7 In vivo skin imaging of healthy people:(a)CARS imaging signal; (b)two-photon excitation fluorescence/SHG imaging signal; (c)signal overlay of CARS- two-photon excitation fluorescence/SHG imaging[7]

3 產(chǎn)業(yè)化及應(yīng)用

圖8 JenLab的多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)MPTflex[5] Fig.8 Multi-photon skin screen system of JenLab—MPTflex[5]

德國(guó)JenLab公司已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多光子皮膚檢測(cè)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化(圖 8)。其產(chǎn)品使用近紅外飛秒激光脈沖對(duì)皮膚組織進(jìn)行照射，可得到自發(fā)熒光、SHG、CARS的3種成像信號(hào)，形成對(duì)皮膚組織結(jié)構(gòu)成分的圖像；同時(shí)，利用熒光壽命成像技術(shù)能夠得到皮膚組織的微環(huán)境信息，以分析活體組織的生理、病理性狀況[3]。由于雙光子技術(shù)具有很好的共聚焦效應(yīng)，且長(zhǎng)波長(zhǎng)光具有較小的吸收和散射系數(shù)，這一系統(tǒng)能夠得到深度范圍較大(能夠達(dá)到幾百微米級(jí)別)的光學(xué)層析成像，因此能夠檢測(cè)分析皮膚組織各個(gè)層次的結(jié)構(gòu)與生理情況。同時(shí)，近紅外光對(duì)生物組織和熒光團(tuán)的損傷均極小[1]，因此這一系統(tǒng)具有很好的安全性與無(wú)創(chuàng)性，并大大減輕了光漂白對(duì)熒光成像的影響。

多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)在早期皮膚癌癥影像診斷、皮膚衰老檢測(cè)等方面均發(fā)揮著一定的作用[18]，下面以檢測(cè)皮膚衰老為例，簡(jiǎn)要介紹該檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用。

在人體皮膚衰老的過(guò)程中，真皮層中的膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的形態(tài)、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。同時(shí)，膠原蛋白纖維與彈性蛋白纖維的分布也會(huì)發(fā)生改變[11]。圖9展示了在多光子層析成像中，纖維形態(tài)與伸展的不同狀態(tài)，SHG信號(hào)由膠原蛋白纖維產(chǎn)生，自發(fā)熒光信號(hào)由彈性蛋白纖維產(chǎn)生。

圖9 不同纖維形態(tài)的多光子層析成像圖對(duì)比(左：SHG信號(hào)；右：自發(fā)熒光信號(hào))[19] Fig.9 Contrast of different fiber morphology MPT images (left: SHG signal; right: auto-fluorescence signal)[19]

在SHG成像中，衰老皮膚真皮層的膠原蛋白纖維呈絲狀(圖9(a1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維卻是不定型的(圖9(a2))。這可能是由于年輕皮膚真皮層中的膠原蛋白纖維含量豐富，纖維組織緊實(shí)致密，因而呈現(xiàn)出不定型的外表；而衰老皮膚中的膠原蛋白含量減少，排列較為稀疏，因此呈現(xiàn)出絲狀。同時(shí)，衰老皮膚真皮層中的膠原蛋白表現(xiàn)為彎曲伸展(圖9(c2))，中年皮膚的膠原蛋白表現(xiàn)為直線(xiàn)伸展(圖9(c1))，而年輕皮膚的膠原蛋白纖維排列致密，難以分辨伸展情況。在自發(fā)熒光成像中，衰老皮膚真皮層中的彈性蛋白纖維排列結(jié)構(gòu)混亂(圖9(b2))，并且彎曲伸展(圖9(d2))；而年輕皮膚中的彈性纖維具有良好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖9(b1))，且直線(xiàn)伸展(圖9(d1))[19]。對(duì)于膠原蛋白纖維和彈性蛋白纖維的分布，年輕皮膚真皮層中兩者信號(hào)呈均勻的散狀分布，而在衰老皮膚真皮層中，彈性蛋白纖維信號(hào)大大增強(qiáng)，而膠原蛋白信號(hào)僅能在基底膜下很小的區(qū)域被檢測(cè)到[20]。這也與隨著皮膚衰老，膠原蛋白纖維減少而彈性蛋白纖維增多的組織學(xué)結(jié)論相符合[10]。

4 結(jié) 論

多光子皮膚檢測(cè)技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)。首先，多光子技術(shù)具有很好的共聚焦特性，因此能夠?qū)ζつw組織進(jìn)行較好的層析成像；其次，雙光子熒光技術(shù)需要的激發(fā)光波長(zhǎng)為普通單光子激發(fā)波長(zhǎng)的兩倍，能量較低，對(duì)組織的損傷小，使安全的活體檢測(cè)成為可能；同時(shí)，較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光具有較小的散射與吸收系數(shù)，相比一般的共聚焦技術(shù)，能夠探測(cè)到更深的組織結(jié)構(gòu)；最后，該技術(shù)將熒光強(qiáng)度的探測(cè)成像與熒光壽命的探測(cè)成像結(jié)合起來(lái)，不僅能夠?qū)M織內(nèi)部物質(zhì)的形態(tài)進(jìn)行成像，也能分析組織的物質(zhì)組成、代謝以及生理病理情況，實(shí)現(xiàn)多種模態(tài)的結(jié)合，使得檢測(cè)結(jié)果更具有應(yīng)用價(jià)值。

當(dāng)然，此技術(shù)也存在一些不足。由于熒光壽命成像相對(duì)傳統(tǒng)熒光成像而言所需的時(shí)間較長(zhǎng)，在成像期間，被檢測(cè)者必須保持完全靜止不動(dòng)才能獲得較好質(zhì)量的圖像[11]。因此，縮短成像的時(shí)間能改善圖像質(zhì)量，并提高患者的就醫(yī)體驗(yàn)。同時(shí)，此系統(tǒng)的單次成像區(qū)域相對(duì)臨床上實(shí)際待檢區(qū)域(例如皮膚損傷區(qū)域)而言面積較小，若能開(kāi)發(fā)算法實(shí)現(xiàn)圖像的連續(xù)獲取與自動(dòng)整合，實(shí)現(xiàn)較大區(qū)域范圍內(nèi)的皮膚成像[11]，將對(duì)臨床診斷大有裨益。

多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)也可通過(guò)結(jié)合其他種類(lèi)的影像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)更多模態(tài)的檢測(cè)。例如中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院醫(yī)工所生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究室在2016年實(shí)現(xiàn)了光聲、雙光子、二次諧波成像3種技術(shù)的集成，成功對(duì)皮膚組織的微血管、細(xì)胞、膠原纖維進(jìn)行了無(wú)標(biāo)記在體成像[21]，為皮膚組織的臨床檢測(cè)提供更全面的生理信息。此外，該系統(tǒng)也可通過(guò)進(jìn)一步集成皮膚血管血流量、血氧檢測(cè)等手段，為病理檢測(cè)提供關(guān)鍵的生物特征信息。最后，在智能醫(yī)療快速發(fā)展的今天，將此多光子皮膚檢測(cè)系統(tǒng)與機(jī)器學(xué)習(xí)、圖像自動(dòng)分割相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)一些病灶的自動(dòng)檢出，輔助醫(yī)生進(jìn)行診斷，不失為此類(lèi)醫(yī)學(xué)影像系統(tǒng)的未來(lái)發(fā)展方向之一。