路 瑤,胡正利,應(yīng)佚倫,龍億濤

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 結(jié)構(gòu)可控先進(jìn)功能材料及其制備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

根據(jù)不同待測物分子穿過納米孔道時(shí)造成的離子流阻斷時(shí)間和程度不同，納米孔道單分子電化學(xué)技術(shù)可在單分子水平實(shí)時(shí)獲取待測物分子的結(jié)構(gòu)、電荷、尺寸等信息[1-3]。生物納米孔道因其原子精度的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和超高空間限域分辨能力，近年來被廣泛應(yīng)用于核酸、多肽、蛋白等生物分子的檢測研究[4-13]。Aerolysin 是一類來自嗜水氣單胞菌屬的β-成孔毒素，其水溶性單體在水溶液中能夠自發(fā)地聚合成七聚體的形態(tài)，形成形似蘑菇的跨膜蛋白孔道[14]。相比于其他種類應(yīng)用更為廣泛的生物納米孔道，如a-Hemolysin(a-HL)和Mycobacterium smegmatis porin A(MspA)，Aerolysin 納米孔道具有更窄的孔徑(約1 nm)[15]。此獨(dú)特結(jié)構(gòu)為單分子穿孔提供了更狹小的限域空間，提高了對單個(gè)堿基差異電流阻斷信號的分析能力[16]。Aerolysin 的另一個(gè)特點(diǎn)是其孔道內(nèi)具有帶正電荷的氨基酸殘基，可增強(qiáng)核酸分子與孔道內(nèi)壁的靜電相互作用，減慢核酸分子的穿孔速率，使得電流阻斷時(shí)間增長，有利于獲得單個(gè)核酸分子更為準(zhǔn)確的細(xì)節(jié)信息[9,17-18]。這些獨(dú)有的優(yōu)勢使得 Aerolysin 納米孔道在生物分子的分析中具有良好的應(yīng)用前景。本課題組前期研究中利用野生型Aerolysin生物膜蛋白，在無需對納米孔道蛋白突變的情況下實(shí)現(xiàn)了單個(gè)核苷酸超靈敏分辨，且對單個(gè)單鏈DNA(ssDNA)單堿基長度差異的分辨率高達(dá)12%～17%[9]；該研究通過使用Aerolysin直接識別DNA寡聚體上的4種堿基，在此過程中無需固定DNA、組裝適配體、酶處理等操作，具有低成本、無標(biāo)記、直接檢測、無酶作用的優(yōu)勢[19]。在此基礎(chǔ)上，本文在ssDNA模板上設(shè)計(jì)引入線性側(cè)鏈基團(tuán)，在Aerolysin納米孔道中實(shí)現(xiàn)了與其它兩種未修飾ssDNA之間單個(gè)堿基差異的非標(biāo)記直接識別，進(jìn)一步提高了Aerolysin納米孔道的單堿基測量能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1,2-二植烷酰基磷脂(1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，美國Avanti Polar Lipids公司)；乙二胺四乙酸(≥99%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris,≥99%)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀(≥99%)、癸烷(≥99%)均購于美國Sigma-Aldrich有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀(Millipore)制備的超純水(電導(dǎo)率為18 MΩ·cm-1,25 ℃)；實(shí)驗(yàn)所用DNA分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4均購于上海生工生物工程股份有限公司；Aerolysin表達(dá)、純化、組裝與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20-21]。直徑1.0 mm的電極銀絲購于英國Alfa Aesar公司。

納米孔檢測微池購于美國Warner Instruments公司，由 cis 檢測池和 trans 檢測池構(gòu)成。其中trans檢測池上支撐磷脂膜的微孔直徑為50 μm。納米孔道實(shí)驗(yàn)檢測裝置包括：Axon Axopatch 200B電流放大器，AxonDigidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器，Clampex 10.7數(shù)據(jù)記錄軟件，ClampFit 10.7數(shù)據(jù)處理軟件(美國Axon Instruments公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制使用水配制pH 8.0的電解質(zhì)溶液，其中含有1 mol/L KCl、10 mmol/L Tris、1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。使用水配制pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液，其中含有10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA。Proaerolysin溶于Tris-HCl緩沖溶液并配制成濃度為10 μg/mL蛋白溶液，納米通道實(shí)驗(yàn)前加入胰蛋白酶活化[22]；1,2-二植烷?；字苡诠锿椴⑴渲瞥蓾舛葹? mg/mL磷脂溶液；DNA溶于Tris-HCl緩沖溶液并配制成濃度為100 μmol/L的溶液。

1.2.2磷脂雙層膜的構(gòu)建用磷脂刷蘸取少量磷脂溶液在納米孔trans檢測池50 μm微孔內(nèi)外均勻涂抹磷脂溶液。通過提拉法形成磷脂雙分子層膜，并通過膜電容及擊穿電壓監(jiān)測其厚度及機(jī)械強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)通過一對Ag/AgCl電極向磷脂雙分子層膜兩端施加驅(qū)動(dòng)電壓并指定cis端為虛擬地，cis與trans檢測池中分別加入含1 mol/L KCl的10 mmol/L Tris-EDTA溶液(pH 8.0)。

1.2.3單個(gè)生物納米孔道實(shí)驗(yàn)形成磷脂雙層膜后，在cis端檢測池中注入0.5 μL Aerolysin蛋白溶液。單個(gè)Aerolysin在磷脂雙分子層膜上自組裝形成一個(gè)穩(wěn)定的納米通道時(shí),離子流將產(chǎn)生量子化階躍即得到開孔電流信號。單個(gè)Aerolysin 納米孔道在22 ℃、1 mol/L Tris-KCl電解質(zhì)溶液、100 mV 電壓條件下產(chǎn)生開孔電流約為48 pA。隨后,將待測生物分子加入檢測池中,在5 kHz濾波下以100 kHz采樣頻率進(jìn)行信號記錄。本實(shí)驗(yàn)3種分析物Poly(dA)4-alkynyl、Poly(dA)5和Poly(dA)4在cis端檢測池體中濃度均為2 μmol/L。實(shí)驗(yàn)溫度控制在(22±2) ℃。

1.2.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理時(shí),將阻斷電流小于10 pA的事件視為噪音干擾,不做進(jìn)一步分析。每一個(gè)阻斷電流大于10 pA的事件均通過MOSAIC軟件處理得到其阻斷電流及阻斷時(shí)間。進(jìn)一步，利用Origin軟件(OriginPro 9.1)獲得單分子事件的阻斷時(shí)間統(tǒng)計(jì)直方圖及阻斷電流統(tǒng)計(jì)直方圖。

2 結(jié)果與討論

Poly(dA)5是由5個(gè)腺嘌呤核苷酸組成的寡聚核苷酸，在以往Aerolysin生物納米孔道單分子研究中發(fā)現(xiàn)其信號具有阻斷電流分布窄、電流分辨率高的特點(diǎn)[9]。本研究以寡聚核苷酸Poly(dA)5為模板，如圖1A所示，在其中間位點(diǎn)引入炔基衍生物線性側(cè)鏈從而設(shè)計(jì)單堿基位點(diǎn)變異的寡聚核苷酸Poly(dA)4-alkynyl，引入炔基衍生物線性側(cè)鏈后其相對分子質(zhì)量相較Poly(dA)4增加251.1，相對分子質(zhì)量增幅小于1個(gè)腺嘌呤核苷酸。進(jìn)一步設(shè)計(jì)將結(jié)構(gòu)差異1個(gè)腺嘌呤核苷酸的Poly(dA)4與Poly(dA)5、Poly(dA)4-alkynyl對照實(shí)驗(yàn)，以研究單個(gè)堿基修飾對納米孔道特征阻斷電流的影響。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[23]，ssDNA分子從 cis 端進(jìn)入且穿過Aerolysin 納米孔道所造成的過孔信號具有電流阻斷呈現(xiàn)集中高斯分布、電流阻斷時(shí)間長(>0.13 ms)的特征；而ssDNA碰撞Aerolysin納米孔道cis端入口后最終返回cis 端溶液的單分子事件會(huì)產(chǎn)生尖刺狀的離子流信號，此類信號產(chǎn)生的電流阻斷時(shí)間短(<0.13 ms)且電流阻斷程度分布范圍較廣。本研究對阻斷時(shí)間大于0.13 ms的分子過孔信號進(jìn)行分析，將單個(gè)阻斷電流信號的電流值定義為I,Aerolysin 納米孔道的開孔電流定義為I0,則單個(gè)ssDNA分子停留在Aerolysin孔道內(nèi)造成的阻斷電流程度為I/I0(Residual Current%)，I/I0值越小代表阻斷程度越大；Duration代表分子穿孔造成電流阻斷所持續(xù)的時(shí)間。如圖1B所示，3種ssDNA分子在100 mV電壓下穿過納米孔道均產(chǎn)生特征的阻斷電流信號。其各自阻斷電流幅值恒定且與其他2種分子在阻斷程度和阻斷時(shí)間上有顯著差異。以阻斷時(shí)間為縱坐標(biāo),阻斷程度為橫坐標(biāo)，統(tǒng)計(jì)繪制100 mV 電壓下阻斷電流的散點(diǎn)圖(如圖1C)。將阻斷程度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，3種分析物在100 mV下阻斷程度直方圖均符合高斯分布，Poly(dA)5和Poly(dA)4的I/I0值分別為0.45和0.52。因此，在ssDNA結(jié)構(gòu)上多1個(gè)腺嘌呤核苷酸使得納米孔阻斷電流程度I/I0值減小了0.07，即阻斷電流I增強(qiáng)了3 pA。而Poly(dA)4-alkynyl的阻斷程度I/I0值為0.38，其相較于Poly(dA)5的I/I0值減小了0.07，阻斷電流I增強(qiáng)了3 pA。因此，單個(gè)炔基側(cè)鏈基團(tuán)的引入對阻斷電流程度的增強(qiáng)效果等同于增加1個(gè)腺嘌呤核苷酸。更重要的是，單個(gè)堿基修飾的Poly(dA)4-alkynyl分子的阻斷電流高斯峰半峰寬較Poly(dA)5減小了44%。因此，單堿基修飾結(jié)構(gòu)有效提升了納米孔道對ssDNA分子的分辨能力(圖2A～C)。

圖1 ssDNA通過Aerolysin納米孔道實(shí)驗(yàn)的原理圖

如圖2D～E所示，相較于Poly(dA)5和Poly(dA)4，Poly(dA)4-alkynyl分子中炔基側(cè)鏈的引入延長了單個(gè)核酸分子的阻斷時(shí)間，其阻斷時(shí)間擬合高斯峰中心為41.0 ms，與未修飾線性側(cè)鏈的Poly(dA)5(擬合高斯峰中心為6.2 ms)、Poly(dA)4(擬合高斯峰中心位于6.6 ms)相比，將單個(gè)ssDNA通過納米孔的速度減緩約80%，使短鏈ssDNA在Aerolysin納米孔道中的時(shí)間分辨提高近7倍。炔基側(cè)鏈的引入使得寡聚腺嘌呤核苷酸上具有1個(gè)堿基位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)變異，其單堿基水平上的結(jié)構(gòu)和電荷改變可以通過Aerolysin納米孔道實(shí)現(xiàn)靈敏檢測。

圖3 Poly(dA)4-alkynyl在不同電壓下的阻斷電流程度直方圖

3 結(jié) 論

本文利用單個(gè)Aerolysin納米孔道在無需標(biāo)記、無需擴(kuò)增的條件下可直接分辨3種具有單個(gè)堿基差異的單鏈DNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具有單個(gè)炔基側(cè)鏈基團(tuán)修飾的單個(gè)ssDNA在限域空間內(nèi)與Aerolysin納米孔道的相互作用增強(qiáng)，電流阻斷程度增大，阻斷時(shí)間較未修飾ssDNA有效延長，且電流阻斷高斯峰半峰寬顯著減小。因此，單堿基側(cè)鏈的引入增強(qiáng)了Aerolysin納米孔道對單個(gè)核酸分子電流的分辨能力，有望推動(dòng)Aerolysin納米孔在DNA直接測序及表觀修飾檢測中的應(yīng)用。