周嬋媛，趙曉娟*，王春利，曾曉房，白衛(wèi)東

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.中華人民共和國(guó)江門海關(guān)，廣東 江門 529000)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一種相對(duì)分子量較低的有機(jī)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中至少含有一個(gè)氮原子，主要由其前體氨基酸通過相應(yīng)的氨基酸脫羧酶代謝[1]生成，廣泛存在于食物[2-3]和飲料中[4-5]。生物胺通常被認(rèn)為是魚類及其產(chǎn)品或貝類中微生物衰變程度的關(guān)鍵性化合物[6-7]，而組胺(Histamine)是這類化合物中生物化學(xué)活性最強(qiáng)的化合物之一[8]，也是人體體液中重要的生物標(biāo)志物[9-10]。通常人們無法從魚的顏色和氣味觀察到組胺的存在，但是組胺會(huì)引起鯖魚綜合征：人體攝入過量的組胺可引起特定的不良生理和毒性作用，如對(duì)心臟、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、平滑肌和胃產(chǎn)生負(fù)面影響[11]，組胺通常被認(rèn)為是食品生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中用于質(zhì)量控制監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物之一[12]。因此，有必要建立一種快速、靈敏地測(cè)定組胺的分析方法。

膠體金(AuCS)又稱納米金溶膠，是由氯金酸被還原成金后形成的顆粒懸浮液，其分散相粒子直徑多在1～100 nm，且均勻、穩(wěn)定、呈單一分散狀懸浮在溶液中，形成一種納米金膠體溶液，其顏色呈桔紅色到紫紅色[13]。納米金具有大的比表面積、表面等離子體共振特性、小尺寸效應(yīng)、催化特性、光學(xué)特性以及獨(dú)特的生物親和性等性能，在工業(yè)催化、生物醫(yī)藥、生物分析化學(xué)、食品安全快速檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[14-16]。

本文采用膠體金修飾的玻碳電極(AuCS/GCE)，利用電流～時(shí)間曲線法(I～t法)建立了一種簡(jiǎn)便、靈敏地檢測(cè)組胺的分析方法，優(yōu)化了底液的pH值和組胺的電化學(xué)測(cè)試方法及條件，考察了修飾電極的電化學(xué)性能，并對(duì)帶魚和黃花魚樣品中的組胺含量進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)價(jià)該法在實(shí)際應(yīng)用中的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

KQ118超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Vortex Mixer V6漩渦混勻器(美國(guó)安勝科技有限公司)；HR/T20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)；BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；QSJ-A01F2切碎機(jī)(小熊電器股份有限公司)。采用玻碳電極測(cè)試組胺的實(shí)驗(yàn)均在CHI660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上連接三電極系統(tǒng)模式下進(jìn)行：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，文中所有電勢(shì)均以飽和Ag/AgCl電極為參比。

組胺二磷酸鹽、苯乙胺、精胺、腐胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、亞精胺磷酸鹽六水合物、尸胺二鹽酸鹽、色胺和氯金酸(HAuCl4·3H2O)純度均大約99.8%，購于Sigma-Aldrich公司；硼氫化鈉(NaBH4)、乙酸(CH3COOH)購于天津市福晨化學(xué)試劑廠；殼聚糖(CS)購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸(HClO4)購于上海麥克林生化科技有限公司；正己烷(C6H14)購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司。0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7.0)由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O儲(chǔ)備液混合配制；帶魚和黃花魚購于超市。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.2 玻碳電極的預(yù)處理

玻碳電極(GCE)依次在專用絨毛拋光墊上用1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3粉拋光成鏡面，用水洗凈后，分別于50%硝酸溶液、無水乙醇和水中各超聲1 min，再將電極置于0.5 mol/L硫酸溶液中，于-1.0～1.0 V電位范圍內(nèi)以50 mV/s的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描直至得到穩(wěn)定的響應(yīng)曲線。最后將處理好的電極放置于室溫下晾干備用。

1.3 膠體金修飾電極(AuCS/GCE)的制備

1.3.1AuCS的制備使用硼氫化鈉為還原劑,CS為保護(hù)劑，參考文獻(xiàn)[17]制備AuCS：首先稱取一定量CS充分溶解于30 mL 1.0%乙酸溶液中配成2 mg/mL溶液；在磁力攪拌下加入15 mL 0.01 mol/L的氯金酸溶液，繼續(xù)攪拌30 min后，再逐滴加入6 mL 0.1 mol/L的硼氫化鈉溶液，繼續(xù)攪拌至溶液呈透明的酒紅色。制備過程中所用玻璃儀器均需在王水(HNO3-HCl，體積比1∶3)中洗凈。

1.3.2AuCS/GCE的制備在預(yù)處理好的GCE表面滴加3 μL AuCS，確保AuCS完全覆蓋電極表面，室溫晾干后制得AuCS/GCE。

1.4 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[18]處理樣品：精密稱取2.0 g已粉碎帶魚或黃花魚樣品于50 mL離心管中，加入8 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，渦旋振蕩混勻1 min，以10 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取一次，合并2次上清液于25 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度。準(zhǔn)確移取10.00 mL樣品提取液置于離心管中并加入10 mL正己烷，漩渦振蕩5 min，棄去上層有機(jī)相，重復(fù)提取2次，合并提取液，待測(cè)。

加標(biāo)回收樣品的前處理：精確稱量2.0 g已粉碎樣品于50 mL離心管中，加入組胺配成不同濃度(0.1、0.26、0.5 mmol/L)的加標(biāo)溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定，平行實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 檢測(cè)方法

采用三電極電化學(xué)測(cè)試系統(tǒng)，以pH 12.0 PBS為支持電解質(zhì)。在初始電位1.0 V條件下，于勻速攪拌的PBS中，利用I～t法掃描約300 s直至基線穩(wěn)定，然后每隔50 s加入定量的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 工作電極的選擇

分別將金電極(GE)、鉑電極(PE)和GCE置于1.0 mmol/L組胺的PBS溶液(pH 12.0)中，利用方波伏安法(SWV)在0.2～1.2 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GE和PE相比，組胺在GCE上的氧化峰電流明顯(圖1)，說明組胺在GCE表面發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)具有較高的響應(yīng)靈敏度，所以選用GCE為測(cè)定組胺的工作電極。

2.2 底液pH值的選擇

采用Tris-HCl(pH 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和PBS(pH 4.0、7.0、10.0、12.0)分別配制1.0 mmol/L組胺溶液，考察各濃度組胺溶液在GCE上的響應(yīng)電流值。發(fā)現(xiàn)在不同pH值的Tris-HCl底液中組胺均未產(chǎn)生氧化峰。在pH值為4.0、7.0、10.0的PBS底液中(圖2A)，1.0 mmol/L組胺未見明顯的響應(yīng)電流；而當(dāng)PBS底液的pH值達(dá)12.0時(shí)，組胺出現(xiàn)明顯的氧化峰，且峰形良好，這可能是由于組胺發(fā)生電子轉(zhuǎn)移時(shí)伴隨著質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，從而使其電化學(xué)響應(yīng)與底液的pH值具有依賴關(guān)系，隨著底液pH值的升高，組胺的氧化峰電位負(fù)移至測(cè)試的電位范圍內(nèi)。進(jìn)一步考察了不同濃度的組胺溶液(以pH 12.0 PBS為底液)在GCE上的電化學(xué)響應(yīng)(圖2B)，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)峰電流隨組胺濃度的增加而增大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 12.0的PBS作為測(cè)試底液。

2.3 電化學(xué)測(cè)試技術(shù)的選擇

將GCE置于0、10.0、100、1 000 μmol/L組胺溶液(用pH 12.0 PBS溶液配制)中進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)、SWV、差分脈沖伏安法(DPV)和I～t法掃描，結(jié)果見圖3。由圖3A、B和C可見，采用CV、SWV、DPV法測(cè)試10.0 μmol/L組胺時(shí)，其電流值響應(yīng)小，靈敏度低，無法在實(shí)際中應(yīng)用。而采用I～t法測(cè)試1.0 μmol/L組胺(圖3D中出現(xiàn)第1個(gè)階梯時(shí)的組胺濃度)時(shí)具有明顯的響應(yīng)，表明在測(cè)定組胺時(shí)，I～t法比其他3種測(cè)試方法具有更高的測(cè)試靈敏度，故選擇I～t法對(duì)組胺進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

2.4 電極修飾材料的選擇

分別采用膠體金(AuCS)、粘土(Clay)和膠體金/粘土(AuCS/Clay)對(duì)GCE進(jìn)行修飾，比較組胺在修飾電極上的響應(yīng)電流值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與GCE相比，在電極表面修飾粘土后，響應(yīng)基線更加穩(wěn)定平滑，但組胺的響應(yīng)電流值未發(fā)生明顯變化，且粘土修飾膜的穩(wěn)定性較差，在淋洗和測(cè)定過程中易脫落。而AuCS中的殼聚糖具有良好的黏附性，可改善修飾電極的穩(wěn)定性，使用AuCS和AuCS/Clay修飾電極時(shí)均能增加組胺的響應(yīng)電流，且僅修飾AuCS的電極響應(yīng)靈敏度增加更顯著，因此，選用AuCS為GCE的修飾材料。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了AuCS/GE、AuCS/PE和AuCS/GCE 3種修飾電極在1.0 mmol/L組胺的PBS溶液(pH 12.0)中的氧化峰電流，利用SWV在0.2～1.2 V電壓范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與AuCS/GE和AuCS/PE相比，組胺在AuCS/GCE上的氧化峰電流明顯，且峰形較好，因此選用AuCS/GCE作為測(cè)定組胺的工作電極。

2.5 初始電位的選擇

將AuCS/GCE放入1.0 mmol/L組胺溶液中，連接三電極系統(tǒng)，測(cè)得開路電位為0.55 V。采用SWV法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)組胺在0.75 V附近有一個(gè)明顯的氧化峰。根據(jù)開路電位和氧化峰電位，設(shè)置I～t法的初始電位分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 V，考察初始電位對(duì)不同濃度組胺在AuCS/GCE上電化學(xué)響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，初始電位為0.5、0.6、0.7、0.8、1.2 V時(shí)，組胺在AuCS/GCE表面均無明顯的響應(yīng)。當(dāng)初始電位為0.9、1.0、1.1 V時(shí)，組胺在AuCS/GCE上產(chǎn)生了明顯響應(yīng)，且1.0 V時(shí)組胺的響應(yīng)電流值最大，因此，實(shí)驗(yàn)選擇I～t法測(cè)試組胺的初始電位為1.0 V。

2.6 性能測(cè)試

2.6.1重現(xiàn)性在相同條件下制備5支AuCS/GCE，分別測(cè)試濃度為4.0、7.9 μmol/L的組胺溶液，得其響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.6%和4.8%，表明AuCS/GCE具有良好的重現(xiàn)性。

2.6.2干擾實(shí)驗(yàn)考察10倍于組胺濃度的腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、苯乙胺、色胺和酪胺對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示，腐胺、尸胺、苯乙胺、精胺、亞精胺不干擾組胺的測(cè)定，而色胺和酪胺產(chǎn)生了明顯的電流響應(yīng)。由于魚樣中色胺的含量極低[19-21]，在實(shí)際應(yīng)用中基本不干擾測(cè)定。而酪胺雖干擾測(cè)定，但其在SWV上的氧化峰位于0.45 V左右，與組胺(0.75 V)的氧化峰間隔較遠(yuǎn)，采用本方法測(cè)定為陽性樣品時(shí)可補(bǔ)充SWV實(shí)驗(yàn)進(jìn)行區(qū)分。

圖4 組胺的電流響應(yīng)值與其濃度的關(guān)系曲線

2.7 組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，使用I～t法考察了不同濃度(0.1、0.35、0.59、0.98、5.8、9.7、14、28、64 μmol/L)組胺在AuCS/GCE上響應(yīng)電流的變化(圖4)，結(jié)果顯示，隨著組胺濃度的增加，I～t曲線呈階梯式下降，其響應(yīng)電流(-I,μA)與其濃度(c,μmol/L)在0.1～64 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：-I=0.053 12c-0.007 17(r=0.997，n=9)，以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得到AuCS/GCE對(duì)組胺的檢出限為0.033 μmol/L。

2.8 樣品分析與回收率的測(cè)定

取帶魚和黃花魚在優(yōu)化條件下采用本方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，帶魚中組胺的含量為86.2 mg/kg，在黃花魚中的含量為49.2 mg/kg。對(duì)帶魚和黃花魚樣品分別進(jìn)行0.1、0.26、0.5 mmol/L 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，組胺在帶魚和黃花魚樣品中的回收率分別為94.4%～106%、91.8%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.2%、2.5%，表明方法具有良好的可靠性和準(zhǔn)確度，且實(shí)際樣品測(cè)試時(shí)間小于6 min。

3 結(jié) 論

本文建立了一種快速檢測(cè)食品中組胺的電化學(xué)分析方法，采用AuCS修飾GCE電極，制作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性良好，與未修飾的GCE相比，組胺的電化學(xué)響應(yīng)明顯增強(qiáng)，可用于市售帶魚和黃花魚中組胺含量的測(cè)定。