陳 磊,吳赟琦,趙志勇,趙曉燕,周昌艷*

( 1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201403；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

氟喹諾酮類抗生素(FQs)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類感染性疾病的治療，具有生物活性和累積性，可通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境[1]，沉積物/土壤的吸附作用是其遷移的主要途徑之一[2]。FQs對(duì)植物和水生生物有毒，由于其在全球范圍內(nèi)的大量使用以及對(duì)土壤的高親和力，很可能通過(guò)植物進(jìn)入人類食物鏈，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成威脅[3]。

QuEChERS是相對(duì)較新的樣品前處理方法，通常包括乙腈提取、鹽析分層和基質(zhì)分散萃取凈化等步驟，已被廣泛應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品的預(yù)處理[10]。QuEChERS方法用于測(cè)定土壤中有機(jī)化合物殘留時(shí)，一般需加水重構(gòu)基質(zhì)條件，采用超聲等輔助提取，改進(jìn)凈化材料消除復(fù)雜基質(zhì)干擾，以提高檢測(cè)方法的回收率[11]。Guo 等[12]開(kāi)發(fā)了QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定豬糞中抗生素的方法，其中喹諾酮類抗生素的回收率低，其采用內(nèi)標(biāo)法消除基質(zhì)效應(yīng)[13]。Zhao 等[14]采用離子交換固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定有機(jī)肥料中的抗生素，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法校正環(huán)丙沙星和諾氟沙星的定量結(jié)果。汪建妹等[15]采用QuEChERS結(jié)合柱凈化的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定有機(jī)肥中的46種抗生素，通過(guò)提高緩沖溶液pH值的方法來(lái)提升喹諾酮類抗生素的回收率。研究顯示，提高緩沖液pH值并不能保證FQs的回收率均較理想[9]。本文建立了QuEChERS前處理結(jié)合UPLC-MS/MS快速檢測(cè)土壤中19種FQs的方法，該方法添加內(nèi)標(biāo)物校正，采用超聲輔助提取，改進(jìn)了快速基質(zhì)分散固相萃取(d-SPE)凈化柱，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

Na2HPO4·2H2O、C6H8O7·H2O(分析純，上海Macklin公司)，Na2EDTA·2H2O(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇、乙腈、乙酸(色譜純，德國(guó)Merck公司)，甲酸(分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，Nylon66濾頭(0.22 μm，美國(guó)Pall公司)，鹽包(上海CNW公司，每袋含4 g硫酸鎂、1 g 氯化鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉、1 g檸檬酸鈉)，基質(zhì)分散固相萃取凈化柱(d-SPE，北京廣普達(dá)公司)，進(jìn)樣瓶(美國(guó)Agilent公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水儀制備。0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液：將15 g Na2HPO4·2H2O、13 g C6H8O7·H2O和36.6 g Na2EDTA·2H2O溶于1 L水中制得[12]。

1.2 儀器與設(shè)備

ST-16R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，多管式旋渦混合器(美國(guó)Talboys公司)，2500 TH超聲波清洗器(上海安譜公司)，移液槍(日本島津公司)，N-EVAP112氮吹儀(上海曲晨機(jī)電技術(shù)公司)，Waters Acquity高效液相色譜儀，C18色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm，美國(guó)Waters公司)，Qtrap-5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品：氧氟沙星、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、甲磺酸達(dá)氟沙星、氟甲喹、鹽酸二氟沙星、依諾沙星、司帕沙星、奧比沙星、左氧氟沙星水合物、帕珠沙星、安妥沙星、那氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、鹽酸洛美沙星、鹽酸沙拉沙星、麻保沙星，以及氘代恩諾沙星(ENR-D5)、氘代諾氟沙星(NOR-D5)、氘代環(huán)丙沙星(CIP-D8)，純度均大于98%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。標(biāo)準(zhǔn)品均以甲醇配制成200～1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存，再用甲醇分別配制上述19種抗生素(10 mg/L)和3種內(nèi)標(biāo)物(10 mg/L)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃儲(chǔ)存。

定量分析時(shí)，除氟甲喹、奧比沙星與那氟沙星不用內(nèi)標(biāo)法校正外，其它16種FQs均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。其中，氧氟沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、二氟沙星、司帕沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、沙拉沙星和麻保沙星以ENR-D5為內(nèi)標(biāo)；諾氟沙星、依諾沙星、帕珠沙星與安妥沙星以NOR-D5為內(nèi)標(biāo)；環(huán)丙沙星以CIP-D8為內(nèi)標(biāo)。

1.4 分析條件

液相色譜條件：柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為甲醇(A)、0.1%甲酸水(B)，進(jìn)樣體積為3 μL，流速為0.3 mL/min。流動(dòng)相洗脫梯度：0～2.0 min，20%A；2.0～5.0 min，20%～30%A；5.0～5.5 min，30%～90%A；5.5～7.0 min，90%～95%A；7.0～7.1 min,95%～20%A；7.1～8.0 min，20%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度500 ℃，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，氣簾氣壓力：275.6 kPa，碰撞氣壓力：55.12 kPa，霧化氣壓力：344.5 kPa。目標(biāo)抗生素的母離子(Q1)、定性/定量離子(Q3)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 19種FQs的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 19 FQs

*quantitative ion

1.5 土壤樣品的制備

空白土壤樣品采自上海市奉賢區(qū)農(nóng)田0～20 cm的表層土壤，其pH值為7.5，有機(jī)質(zhì)含量為1.6%，經(jīng)檢測(cè)未含有目標(biāo)抗生素。樣品經(jīng)剔除雜物，自然風(fēng)干后過(guò)20目土壤篩(孔徑0.83 mm)。

1.6 提取與凈化步驟

稱取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入200 μg/kg的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，靜置1 h，加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液，渦旋1 min，再加入10 mL乙腈，渦旋1 min后，25 ℃下超聲提取15 min，以4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，并將沉降的土樣再次超聲提取，收集2次提取后上清液，用0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液與乙腈混合溶劑(體積比1∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用)將2次提取液補(bǔ)足至40 mL。加入2袋鹽包后，立即密封離心管，劇烈搖動(dòng)1 min，使上述40 mL提取液分層，以4 000 r/min離心5 min后，吸取2 mL上層清液過(guò)d-SPE柱(在5 mL PVC針筒頂端裝有150 mg無(wú)水MgSO4、15 mg PSA、15 mg C18，填料兩端放有隔墊)快速凈化。為減少儀器進(jìn)樣的溶劑效應(yīng)，取過(guò)柱后的溶液1 mL置于玻璃試管中，在45 ℃水浴條件下氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(體積比20∶80)復(fù)溶，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾頭，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

研究表明[13,15]，C18柱適于氟喹諾酮類抗生素殘留的分析，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了T3(1.6 μm,2.1 mm×100 mm)、BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)和HSS T3(1.8 μm,2.1 mm×100 mm)3種不同粒徑ACQUITY UPLC C18柱的分離效果。結(jié)果表明：此3種色譜柱對(duì)19種目標(biāo)物的分離度均較好，其中經(jīng)BEH C18色譜柱分離后的目標(biāo)物峰形更好，所以選其作為分離色譜柱。實(shí)驗(yàn)還對(duì)比了甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，結(jié)果顯示甲醇-0.1%甲酸水的分離效果和峰形較好，因此選擇流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取劑的優(yōu)化氟喹諾酮類抗生素易與土壤中的金屬離子結(jié)合，文獻(xiàn)[14]通過(guò)添加EDTA-McIlvaine緩沖液，使EDTA與金屬離子形成絡(luò)合物，將土壤中的目標(biāo)化合物游離出來(lái)，再添加有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。本實(shí)驗(yàn)加入10 mL 0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液后，考察了分別加入10 mL的乙腈、甲醇-乙腈(體積比1∶3)、乙腈-乙酸(體積比9∶1)提取劑在25 ℃超聲水浴中提取15 min，重復(fù)提取2次的回收率。結(jié)果表明：乙腈作為提取劑時(shí)，19種目標(biāo)物的回收率均大于66.8%，而經(jīng)其它2種溶劑提取的部分目標(biāo)物回收率低于50.0%，因此選擇0.1 mol/L EDTA-McIlvaine緩沖液-乙腈(1∶1)作為混合提取劑，提取時(shí)先加緩沖液，再加乙腈。

2.2.2提取方式的優(yōu)化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑，提取15 min，重復(fù)提取2次條件下，對(duì)渦旋振蕩和25 ℃超聲提取2種提取方式進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：25 ℃超聲提取對(duì)各目標(biāo)物的回收率均大于渦旋振蕩提取。因此選擇25 ℃超聲水浴作為提取方式。

2.2.3提取時(shí)間的優(yōu)化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑，25 ℃超聲提取2次條件下，考察了提取時(shí)間(10、15、20 min)的影響。由圖1可知，提取時(shí)間為10 min時(shí)，DIF和ORB的回收率僅為64.4%和53.3%；提取時(shí)間為15 min時(shí)，目標(biāo)物的回收率均在70.2%以上，平均回收率為85.1%；提取時(shí)間為20 min時(shí)，目標(biāo)物的平均回收率可達(dá)88.5%。為節(jié)省操作時(shí)間，最終選擇提取時(shí)間為15 min。

2.2.4提取次數(shù)的優(yōu)化以EDTA-McIlvaine緩沖液和乙腈(1∶1)為提取劑、25 ℃超聲提取15 min條件下，考察了提取次數(shù)(1次、2次、3次)的影響。結(jié)果表明：19種目標(biāo)物的回收率隨提取次數(shù)的增加而增大，提取1次時(shí)目標(biāo)物的平均回收率為59.3%,提取2次和3次時(shí)的平均回收率分別為84.5%和85.4%，為節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，最終選擇提取2次。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

土壤經(jīng)提取后含有雜質(zhì)，為減少基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用d-SPE凈化柱進(jìn)行快速凈化。對(duì)d-SPE凈化柱中裝填3種凈化材料(無(wú)水MgSO4+PSA+C18)的用量組合進(jìn)行了優(yōu)化，6種組合分別為[16]：A(100 mg+10 mg+25 mg)、B(100 mg+15 mg+15 mg)、C(100 mg+25 mg+25 mg)、D(100 mg+25 mg+10 mg)、E(150 mg+15 mg +15 mg)、F(150 mg+25 mg+25 mg)。土壤樣品加標(biāo)200 μg/kg后，采用“1.6”方法超聲提取2次，加鹽分層后，分別移取2 mL上清液，用以上6種組合材料凈化。結(jié)果表明：當(dāng)PSA或C18的用量為25 mg時(shí)有2～3個(gè)抗生素的回收率低于60%；組合E的回收率最高，回收率為73.8%～96.3%，最終選取組合E(150 mg無(wú)水MgSO4+15 mg PSA+15 mg C18)作為d-SPE凈化劑。

圖1 不同提取時(shí)間下19種FQs的回收率

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1線性范圍為消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的影響，用樣品空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，除了ENO、ANT的線性范圍為5.0～200 μg/L，NOR、PEF的線性范圍為2.0～100 μg/L外，其余目標(biāo)物的線性范圍均為1.0～100 μg/L；相關(guān)系數(shù)(r2)為0.992～0.998。

表2 19種FQs的相關(guān)系數(shù)(r2)、線性范圍、檢出限、定量下限、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs,LOQs,recoveries and RSDs(n=5) for 19 FQs

2.4.2方法檢出限與定量下限在空白土壤樣品中分別添加0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/kg的19種FQs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(n=5)，經(jīng)前處理后上機(jī)檢測(cè)，以各目標(biāo)物的定性、定量離子質(zhì)譜圖響應(yīng)值大于3倍信噪比(S/N)時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為方法檢出限(LOD)，大于10倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為定量下限(LOQ)，得到土壤中19種FQs的LOD為0.2～1.0 μg/kg，LOQ為1.0～5.0 μg/kg。19種FQs在空白土壤基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.0 μg/L)中的定量離子提取色譜圖見(jiàn)圖2，各目標(biāo)化合物在2.5～7.0 min內(nèi)出峰，色譜峰形較好。

2.4.3回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在空白土壤樣品中添加10、50、200 μg/kg的19種FQs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)5個(gè)重復(fù)，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表2。結(jié)果表明：19種FQs在3種加標(biāo)水平下的回收率為65.2%～104%，平均回收率分別為79.8%、82.6%和85.8%，RSD為1.8%～14%，基本滿足GB/T 27404-2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》標(biāo)準(zhǔn)對(duì)回收率和RSD的要求[17]，方法適用于實(shí)際土壤樣品的檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)采自上海市郊區(qū)35個(gè)不同類型農(nóng)田的土壤樣品中FQs殘留進(jìn)行分析，測(cè)得土壤中19種FQs的總含量為9.4～124.9 μg/kg。其中主要是CIP殘留，其檢出率為100%，檢出量為9.4～79.9 μg/kg，平均含量為33.1 μg/kg；其次是NOR、ENR、OFX，檢出率分別為71%、57%、31%，平均檢出量分別為7.3、7.8、5.0 μg/kg；其它抗生素的檢出率均在10%以下，平均檢出量均在10 μg/kg以下。Sun 等[18]對(duì)長(zhǎng)江三角洲地區(qū)241個(gè)土壤樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OFX、ENR、CIP和NOR的總含量平均值為48.8 μg/kg，檢出率分別為72%、75%、83%和73%，平均檢出量分別為5.86、9.98、27.7、11.2 μg/kg。趙晶等[19]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上海市崇明島禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)周圍土壤中OFX、ENR、CIP和NOR的總含量平均值為 144 μg/kg，OFX、ENR和 CIP 的檢出率均為100%，NOR的檢出率為 91%，平均檢出量分別為8.1、86.8、32.0、17.4 μg/kg。本實(shí)驗(yàn)對(duì)土壤樣品中FQs殘留的檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)一致。雖然本實(shí)驗(yàn)中CIP、NOR、ENR和OFX的檢出值不高，但檢出率較高，為了保障禽畜糞污資源化利用以及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期或大量施用糞肥和有機(jī)肥的農(nóng)田土壤中上述4種抗生素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

3 結(jié) 論

本文建立了QuEChERS/UPLC-MS/MS結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定土壤中19種FQs殘留的分析方法，各抗生素的定量下限為1.0～5.0 μg/kg，在10、50、200 μg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率分別為79.8%、82.6%和85.8%，RSD不大于14%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，準(zhǔn)確度較高，能夠滿足目前土壤中氟喹諾酮類抗生素檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需求。