田 許，楊玉輝，王雅楠，張佳紅，郭海濤，施用暉，樂(lè)國(guó)偉,*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

近年來(lái)隨著物質(zhì)生活水平的不斷提高，我國(guó)居民從傳統(tǒng)的植物性食物為主的膳食結(jié)構(gòu)向高脂肪、低碳水化合物的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)展，導(dǎo)致肥胖的發(fā)生率逐年增加[1-2]。當(dāng)前肥胖已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題而被廣泛關(guān)注[3]。許多研究已經(jīng)證明了肥胖是代謝綜合征發(fā)生最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素，而且還是糖尿病、心腦血管疾病和多種癌癥發(fā)生的重要誘因[4]。長(zhǎng)期高脂膳食（high-fat diet，HFD）會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的自由基，破壞氧化還原狀態(tài)的平衡，繼而導(dǎo)致脂代謝的紊亂[5]，最終誘使肥胖發(fā)生。已有大量研究表明通過(guò)飲食中添加抗氧化因子能夠?qū)ρ趸€原狀態(tài)失衡導(dǎo)致的脂代謝紊亂起到良好的改善作用[6-9]。

膠原蛋白肽已被證實(shí)具有降血壓、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、抗腫瘤、改善骨骼和皮膚以及免疫調(diào)節(jié)等多種活性[10-14]。近年來(lái)，陸源性膠原蛋白的開(kāi)發(fā)利用遇到宗教和安全性方面的諸多問(wèn)題，水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)加工利用后的下腳料中因富含膠原蛋白而受到研究者們的重視[15]。魚(yú)膠原蛋白肽（fish collagen peptides，F(xiàn)CPs）是從魚(yú)類(lèi)加工后的皮、骨、鱗和鰭等廢棄物中提取膠原蛋白后經(jīng)過(guò)酶法處理所得[12]。過(guò)去的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)豬骨膠原蛋白肽具有改善HFD小鼠抗氧化和血脂代謝的作用[16]，丁進(jìn)鋒等[17]使用海蜇膠原蛋白肽也觀察到了相似的結(jié)果，但具體的作用機(jī)制還缺乏深入研究。肝臟作為機(jī)體脂類(lèi)消化、吸收、合成、分解和運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所[18]，是很多營(yíng)養(yǎng)功能因子的作用位點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)以HFD C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究FCPs干預(yù)對(duì)HFD小鼠肝臟脂代謝和氧化還原狀態(tài)的影響，為FCPs功能的開(kāi)發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

4 周齡清潔級(jí)C57BL/6雄性小鼠54 只（18～20 g）飼養(yǎng)于江南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，購(gòu)自南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001。

FCPs（食品級(jí)，純度99%，分子質(zhì)量150～2 000 Da） 韓國(guó)Geltech公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）、油紅O試劑盒 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒 上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司；TRIzol裂解液 美國(guó)Biomiga公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 美國(guó)Promega公司；dNTPs 碧云天生物技術(shù)公司；Oligo（dT）、基因引物 上海捷瑞生物工程公司；SYBR Green Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Epoch微孔板分光光度計(jì) 美國(guó)BioTek公司；組織切片機(jī)、包埋機(jī)、脫水機(jī) 德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司；ETC811 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）儀 美國(guó)ABI公司；立式超低溫冷凍冰箱 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂與分組

飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)動(dòng)物房，所有小鼠共處一室，每組6 籠，一籠3 只，自由攝食和飲水，環(huán)境溫度（23f2）℃，相對(duì)濕度（50f10）%，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照。

小鼠以正常飼料適應(yīng)性飼喂一周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3 組，每組18 只：正常膳食組（CON組，含4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）脂肪）；高脂膳食組（HF組，含20%脂肪）；FCPs干預(yù)高脂膳食組（PHF組，含20%脂肪＋1%FCPs）。各組飼料參考AIN93純合氨基酸日糧標(biāo)準(zhǔn)和Hasek等[19]的配方進(jìn)行配制，PHF組的純合氨基酸添加量扣除所加FCPs中各種氨基酸的量。其中添加的脂肪均為豬油，正常飼料的供能總量為16.20 kJ/g，脂肪供能比為11.63%；HF組和PHF組飼料的供能總量為19.55 kJ/g，脂肪供能比為38.54%。

1.3.2 組織樣品的采集

所有小鼠每周稱質(zhì)量并記錄體質(zhì)量，每組按體質(zhì)量隨機(jī)分為兩批各9 只，分別于11、22 周后禁食12 h，摘眼球取血于肝素鈉抗凝管中（4 ℃、3 000 r/min離心10 min后取血漿－80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)），斷頸處死。

冰浴條件下迅速摘取肝臟，稱質(zhì)量記錄后取部分肝臟組織按1∶9（m/V）加入4?℃預(yù)冷的生理鹽水制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min取上清液－80 ℃保存?zhèn)錅y(cè)；取相同部位和大小的兩塊肝臟組織分別放入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液和冷凍固定液中備用；再取100 mg左右肝臟組織于TRIzol中剪碎，液氮速凍后－80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｆ溆喔闻K樣品直接－80 ℃保存。1.3.3 體質(zhì)量增長(zhǎng)率、采食量和表觀脂肪消化率的測(cè)定

將小鼠稱質(zhì)量后放入提前消毒好的代謝籠中適應(yīng)3 d，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)后，收集每只小鼠72 h的糞便待測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中所有小鼠均自由采食和飲水。

記錄飼料投入量和投入時(shí)間，每24 h稱量并記錄食槽中剩余飼料質(zhì)量以及漏入代謝籠內(nèi)的飼料質(zhì)量。連續(xù)監(jiān)測(cè)3 d計(jì)算平均數(shù)。小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率及采食量分別按式（1）、（2）計(jì)算。

分別將每只小鼠的糞便樣品和飼料磨碎后各取1 g，精確稱質(zhì)量，分別包入濾紙后在鋁盒中105?℃烘干至恒質(zhì)量，記錄質(zhì)量，將濾紙包放入索氏抽提器中進(jìn)行脂肪抽提4 h以上，至回流液滴在濾紙上揮發(fā)后沒(méi)有油印為終點(diǎn)。再次將濾紙包烘至恒質(zhì)量后記錄質(zhì)量，前后兩次恒質(zhì)量后的質(zhì)量差即為糞便和飼料中的粗脂肪質(zhì)量。表觀脂肪消化率根據(jù)式（3）計(jì)算。

1.3.4 肝臟脂質(zhì)水平的測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TC、TG和FFA水平的測(cè)定。

1.3.5 肝臟組織切片觀察

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)固定液中的肝臟組織樣品進(jìn)行切片和染色，鏡檢，用Image-Pro圖像軟件對(duì)切片進(jìn)行分析，計(jì)算肝臟脂肪空泡和脂肪浸潤(rùn)面積的比例。

1.3.6 肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定

采用TRIzol法提取肝臟總RNA，甲醛變性電泳鑒定RNA質(zhì)量，測(cè)定濃度后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qPCR測(cè)定乙酰輔酶A羧化酶1（acety1 CoA-carboxylase 1，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase ，F(xiàn)AS）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP1c）、膽固醇7α-羥化酶1（cholesterol 7α-hydroxylase 1，CYP7A1）、過(guò)氧化物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmity1 transferase 1，CPT1）的mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。最終結(jié)果以目的基因相比內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示。

表1 qPCR引物序列Table1 Sequences of the primers used in qPCR

1.3.7 氧化還原指標(biāo)的測(cè)定

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）水平的測(cè)定采用Lumino電化學(xué)發(fā)光法[20]；T-AOC水平、MDA水平、GSH-Px活力和還原型/氧化型谷胱甘肽（ratio of reduced and oxidized glutathione，GSH/GSSG）水平的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以fs表示，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），對(duì)滿足方差齊性的結(jié)果用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，方差不齊時(shí)采用Tamhane檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FCPs對(duì)HFD小鼠體質(zhì)量的影響

圖1 FCPs對(duì)HFD小鼠體質(zhì)量和體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響（n＝9）Fig.1 Effect of FCPs on body mass and mass gain rate in mice fed with HFD (n = 9)

在整個(gè)飼喂周期中，各組小鼠的體質(zhì)量從初始時(shí)沒(méi)有差異（P＞0.05），到第11周時(shí)為快速增長(zhǎng)的階段，隨后進(jìn)入體質(zhì)量增長(zhǎng)相對(duì)平緩的時(shí)期（圖1A）。HF組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)從高脂飼喂開(kāi)始后一直高于CON組，第11、22周時(shí)均有顯著差異，并且結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組的體質(zhì)量和體質(zhì)量增長(zhǎng)率沒(méi)有出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖1B）。

2.2 FCPs對(duì)HFD小鼠采食量和日均采食總能量的影響

第7周時(shí)，HF組的采食量相比CON組有減少趨勢(shì)，而PHF組則有所增加，但均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。至第14周，與CON相比，HF組的采食量顯著減少（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組的采食量增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。到21 周終末，HF組的采食量相比CON組仍保持顯著減少（P＜0.05）；而PHF的采食量相比HF組明顯增加（P＜0.05）（圖2A）。

由于各組飼料配方的不同，同質(zhì)量的正常飼料與高脂飼料所提供的能量并不相同，因此在采食量的基礎(chǔ)上又統(tǒng)計(jì)分析了各組小鼠的日均采食總能量。可見(jiàn)HF組的日均采食總能量與CON組相比在第7、14周均有增加趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與HF組相比，PHF組的日均采食總能量均有增加趨勢(shì)，第7周時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而第14、21周均顯著增加（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 FCPs對(duì)HFD小鼠采食量和日均采食總能量的影響（n＝9）Fig.2 Effect of FCPs on daily food intake and total energy intake in mice fed with HFD (n = 9)

2.3 FCPs對(duì)HFD小鼠脂肪消化吸收的影響

圖3 FCPs對(duì)HFD小鼠脂肪消化吸收的影響（n＝9）Fig.3 Effects of FCPs on fat digestibility in mice fed with HFD (n = 9)

第11、22周時(shí)，與CON組相比，HF組的脂肪表觀消化率顯著降低（P＜0.05）；相比HF組，PHF組的脂肪表觀消化率顯著升高（P＜0.05）（圖3A）。

用脂肪表觀消化率和采食量相乘，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)了各組小鼠的日均脂肪表觀消化量。第11和22周時(shí)，相比CON組，HF組的日均脂肪表觀消化量顯著降低（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組的脂肪表觀消化率在第11、22周時(shí)均顯著增加（P＜0.05）（圖3B）。

2.4 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟質(zhì)量和組織形態(tài)的影響

圖4 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟質(zhì)量的影響（n＝9）Fig.4 Effect of FCPs on liver mass of mice fed with HFD (n = 9)

由圖4可見(jiàn)，在第11、22周時(shí)，相比CON組，HF組的肝臟質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組的肝臟質(zhì)量在第11周時(shí)顯著增加（P＜0.05），至22周時(shí)兩者差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟組織形態(tài)的影響Fig.5 Effect of FCPs on hepatic morphology in mice fed with HFD

對(duì)HE染色的肝臟石蠟切片進(jìn)行鏡檢，相比CON組，可見(jiàn)第11、22周時(shí)HF組小鼠的肝細(xì)胞均出現(xiàn)大量脂肪空泡，細(xì)胞形狀和排列出現(xiàn)紊亂，空泡面積隨飼喂時(shí)間的增長(zhǎng)有明顯變大的趨勢(shì)；與HF組相比，第11周時(shí)，PHF組也出現(xiàn)了較多的脂肪空泡和肝細(xì)胞形態(tài)紊亂，但空泡較小，第22周時(shí)，PHF組的空泡大小和數(shù)量都比HF組有明顯改善（圖5A）。

通過(guò)油紅O染色小鼠肝臟冰凍切片，其中的脂肪被染為紅色，可以觀察到，相比CON組，HF組小鼠的肝臟脂肪浸潤(rùn)程度在第11、22周時(shí)都明顯增加；與HF組相比，PHF組的肝臟脂肪浸潤(rùn)程度在第22周時(shí)明顯降低（圖5B）。

圖6 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪蓄積的影響（n＝4）Fig.6 Effect of FCPs on fat accumulation in liver of mice fed with HFD (n = 4)

由圖6可見(jiàn)，分別統(tǒng)計(jì)HE染色切片中的脂肪空泡面積和油紅O切片中的脂肪浸潤(rùn)面積占視野總面積的比例，來(lái)衡量肝臟脂肪蓄積的程度。相比CON組，第11、22周時(shí)，HF組小鼠的肝臟脂肪空泡面積比和脂肪浸潤(rùn)面積比均顯著增加（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組小鼠在第11、22周時(shí)的脂肪空泡面積比顯著降低（P＜0.05），脂肪浸潤(rùn)面積比在第11周時(shí)沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），第22周時(shí)顯著降低（P＜0.05）。

2.5 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪含量的影響

圖7 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪含量的影響（n＝9）Fig.7 Effect of FCPs on lipid pro fi les in liver of mice fed with HFD (n = 9)

由圖7可見(jiàn)，與CON組相比，HF組第11、22周時(shí)TG、TC和FFA水平均顯著升高（P＜0.05）；與HF組相比，PHF組在第11周時(shí)TG、TC和FFA水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），至第22周時(shí)，PHF組TG和FFA水平顯著下降（P＜0.05），TC水平仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.6 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖8 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)的影響（n＝9）Fig.8 Effect of FCPs on gene expression related to hepatic lipogenesis in mice fed with HFD (n = 9)

由圖8可見(jiàn)，與CON相比，第11周時(shí)HF組的肝臟脂肪合成關(guān)鍵基因表達(dá)均有上調(diào)的趨勢(shì)，其中ACC1 mRNA水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），F(xiàn)AS和SREBP1c mRNA水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），至第22周時(shí)，三者均有顯著上調(diào)（P＜0.05）；相比HF組，PHF組兩個(gè)周期中的ACC1 mRNA水平和第11周時(shí)的SREBP1c mRNA水平均有下調(diào)趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），其他周期中的各脂肪合成關(guān)鍵基因表達(dá)均沒(méi)有明顯變化（P＞0.05）。

2.7 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖9 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響（n＝9）Fig.9 Effect of FCPs on gene expression related to hepatic lipolysis in mice fed with HFD (n = 9)

由圖9可見(jiàn)，與CON組相比，HF組各周期的脂肪分解關(guān)鍵基因表達(dá)均有下調(diào)的趨勢(shì)，其中第11周時(shí)的CPT1 mRNA水平和第22周時(shí)的PPARα mRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.05），其他周期中的各基因表達(dá)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；相比HF組，第11周時(shí)PHF組的CYP7A1 mRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.05），PPARα mRNA水平有下調(diào)趨勢(shì)但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CPT1 mRNA水平有上調(diào)趨勢(shì)但也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第22周終末，PHF組的CYP7A1、CPT1和PPARα的mRNA水平均顯著上調(diào)（P＜0.05）。

2.8 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響

由圖10可見(jiàn)，與CON組相比，HF組的ROS水平在兩個(gè)周期中均顯著增加（P＜0.05）；相比HF組，PHF組的ROS水平表現(xiàn)出減少趨勢(shì)，其中第11周時(shí)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第22周時(shí)顯著減少（P＜0.05）。

圖10 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟ROS水平的影響（n＝9）Fig.10 Effect of FCPs on the level of liver ROS in mice fed with HFD (n = 9)

圖11 FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟氧化還原狀態(tài)的影響（n＝9）Fig.11 Effect of FCPs on liver redox state in mice fed with HFD (n = 9)

由圖11可見(jiàn)，第11周時(shí)，與CON組相比，HF組的肝臟MDA水平顯著增加（P＜0.05）、GSH-Px活力和GSH/GSSG比值顯著降低（P＜0.05），T-AOC水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；相比HF組，PHF組的MDA水平有減少趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），GSH-Px活力和GSH/GSSG比值均顯著升高（P＜0.05），T-AOC水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。至第22周終末，與CON組相比，HF組的T-AOC水平、GSH-Px活力和GSH/GSSG比值顯著降低（P＜0.05），MDA水平顯著增加（P＜0.05）；相比HF組，PHF組的T-AOC水平和GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），MDA水平和GSH/GSSG比值均有改善，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討 論

本研究顯示，在HFD中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% FCPs并沒(méi)有抑制小鼠體質(zhì)量的增加，而李亞欣、朱琳玲等采用2%豬骨膠原蛋白肽干預(yù)則觀察到了小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的抑制[14,16]，這與膠原蛋白肽的來(lái)源、添加量和模型的不同有一定的關(guān)系。一般飼料中油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)3%時(shí)就會(huì)由于膽汁酸分泌量的限制影響禽畜對(duì)飼料中脂肪的吸收，而通常HFD飼料中的脂肪含量高達(dá)20%，勢(shì)必造成其中脂肪不會(huì)完全吸收。本研究在FCPs干預(yù)后觀察到，在自由攝食、飲水和運(yùn)動(dòng)的情況下，PHF組小鼠的采食量、脂肪攝入和能量攝入相比HF組顯著增加，這可能與FCPs作為兩親性物質(zhì)參與了脂肪的乳化吸收有關(guān)。動(dòng)物攝入脂肪和能量的增加勢(shì)必會(huì)引起其體質(zhì)量的增加，然而在本研究中PHF組相比HF組體質(zhì)量并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示FCPs可能通過(guò)增加了機(jī)體對(duì)脂肪的利用來(lái)改善HFD造成體內(nèi)脂肪積蓄和脂代謝紊亂。

HFD導(dǎo)致的肥胖，造成脂代謝紊亂通常表現(xiàn)為體內(nèi)脂肪水平的失衡，特別是肝臟的異常增大和脂肪積累，已有研究表明膠原蛋白肽可以顯著改善機(jī)體的血脂水平[16-17]。本研究表明，F(xiàn)CPs干預(yù)可以顯著改善HFD導(dǎo)致的肝臟脂肪空泡增多、脂肪浸潤(rùn)面積增大、以及甘油三酯和游離脂肪酸水平的升高，通過(guò)減少肝臟的脂肪蓄積對(duì)脂代謝紊亂進(jìn)行調(diào)節(jié)。

ACC1是催化脂肪酸合成第一步反應(yīng)的限速酶[21]；FAS是脂肪酸合成反應(yīng)的另一個(gè)限速酶，在肝臟組織中的表達(dá)較高[22]；SREBP1c則是作為轉(zhuǎn)錄因子選擇性激活脂質(zhì)合成相關(guān)酶的表達(dá)，以此來(lái)調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝[23]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，除FAS mRNA水平外，相比HF組，PHF組FCPs干預(yù)對(duì)肝臟脂肪合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)物ACC1和SREBP1c的mRNA表達(dá)均有一定的下調(diào)，但是都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明FCPs主要作用途徑可能不是通過(guò)抑制脂肪合成實(shí)現(xiàn)的。

CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶，其上調(diào)可以減少腸道對(duì)膽汁酸的重吸收并增加機(jī)體排出膽固醇[24]；PPARα是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的一個(gè)亞型，可以改善機(jī)體對(duì)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用[25]；CPT1是脂肪酸β氧化的限速酶[26]。本研究表明，與HF組相比，PHF組在FCPs干預(yù)11 周時(shí)，會(huì)顯著下調(diào)CYP7A1的mRNA表達(dá)，PPARα的mRNA表達(dá)水平也有下調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明雖然在FCPs的干預(yù)下，由于PHF組在中短期內(nèi)攝入比HF組更多的脂肪和能量，HFD對(duì)PHF組小鼠脂肪分解代謝的干擾更為明顯，這與肝臟脂肪水平的結(jié)果也是一致的；但到第22周時(shí)，F(xiàn)CPs顯著上調(diào)了三者的mRNA表達(dá)水平。因此，盡管PHF組小鼠的脂肪攝入量和能量攝入量在整個(gè)飼喂周期中都顯著高于HF組，并導(dǎo)致中短期飼喂（11 周）時(shí)PHF組的CYP7A1和PPARα的基因表達(dá)水平下降，但長(zhǎng)期飼喂（22 周）時(shí)的相關(guān)結(jié)果說(shuō)明FCPs對(duì)HFD小鼠肝臟脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)，可能與長(zhǎng)期飼喂時(shí)其促進(jìn)脂肪分解代謝密切相關(guān)。

已有大量研究表明功能因子對(duì)HFD導(dǎo)致肥胖的影響與其抗氧化作用密切相關(guān)[8-9,17]。長(zhǎng)期HFD使機(jī)體脂肪攝入處于過(guò)量狀態(tài)，肝臟作為能量代謝的重要器官，代謝水平持續(xù)增高，導(dǎo)致肝細(xì)胞需氧量增加，進(jìn)而誘發(fā)更多ROS的生成，引起肝臟中生物大分子的氧化損傷，肝細(xì)胞失去完整性影響肝臟功能[27]，這是肝臟脂代謝失衡的重要原因。

由于膠原蛋白肽是酶解蛋白得到的混合物，可分離純化得到的具有抗氧化活性的單體肽數(shù)量甚多[28-29]，所以其抗氧化機(jī)制也相對(duì)復(fù)雜，目前已經(jīng)報(bào)道的有直接淬滅自由基、金屬離子螯合以及提供還原力等多種抗氧化途徑[30]。有研究表明膠原蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除能力與其疏水性氨基酸和亞氨基酸含量有關(guān)，而還原力更依賴于羥脯氨酸的含量，也有研究報(bào)道羥脯氨酸的游離羥基具有清除超氧陰離子自由基和羥自由基的能力[31-32]。

從本研究的結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)CPs干預(yù)HFD小鼠11 周時(shí)，相比HF組，PHF組顯著提高了肝臟GSH-Px活力和GSH/GSSG比值，對(duì)肝臟MDA水平也有降低的趨勢(shì)；第22周后，可以觀察到PHF組肝臟T-AOC水平、MDA水平和GSH-Px活力相比HF組的顯著改善，同時(shí)對(duì)GSH/GSSG比值也有改善的趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示FCPs可能首先通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟氧化還原狀態(tài)，繼而調(diào)節(jié)了HFD小鼠肝臟的脂肪分解代謝，但是其中具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

綜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的FCPs能夠減少HFD小鼠肝臟中ROS的產(chǎn)生，改善肝臟的抗氧化能力，促進(jìn)肝臟脂肪分解代謝，減少肝臟中脂肪的蓄積。因此飲食中添加1%FCPs具有改善機(jī)體氧化還原狀態(tài)和脂代謝紊亂的作用。本研究為FCPs的開(kāi)發(fā)利用提供了更進(jìn)一步的理論依據(jù)，具有一定的研究意義。