李 紅，齊寶坤，鐘明明，朱建宇，孫禹凡，胡 淼，王 歡，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

傳統(tǒng)大豆油脂的制取方式主要是采用機(jī)械壓榨法和溶劑浸出法，其中多數(shù)為溶劑浸出法，但是隨著研究的進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)了一種綠色、環(huán)保的新技術(shù)——水酶法/生物酶法。生物解離提取技術(shù)是一種同時從油料種子中提取油脂和蛋白質(zhì)的方法，該方法所得的產(chǎn)品品質(zhì)高，極適合人類食用。雖然生物解離有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是由于酶解處理時間長（通常在2～3 h），酶處理后干燥過程的成本比較高，所以生物解離技術(shù)的應(yīng)用還存在一定的限制。并且在生物解離提油過程中會出現(xiàn)不可避免的乳化現(xiàn)象，大部分大豆油脂殘留在由大豆蛋白和油脂構(gòu)成的乳狀液體系中[1]，導(dǎo)致其包裹的油脂難以從由蛋白與油脂緊密結(jié)合形成的穩(wěn)定乳狀液中被釋放分離，因而限制了油脂的提取率[2]。因此，如何采用高效、綠色、安全的破乳方法將乳狀液中的油脂釋放出來成為提高生物解離油脂提取率的一個重要環(huán)節(jié)。

熱處理破乳法通過增加分子的熱運(yùn)動使乳狀液中的微油脂顆粒聚結(jié)，此外，由于溫度升高時乳狀液黏度降低，進(jìn)一步降低了乳狀液的穩(wěn)定性，并達(dá)到破乳目的。Chabrand等[3]的研究表明，在生物解離提取大豆油脂的過程中所形成的乳狀液表面吸附蛋白含量為（11.40±0.35）mg/m2。相比于水劑法提取技術(shù)中形成的乳狀液吸附蛋白含量（14.65 mg/m2）有所降低[4]。王文睿等[5]采用水浴和油浴加熱破乳的工藝，優(yōu)化了工藝參數(shù)，在加熱溫度為120 ℃、加熱時間為15 min時，其優(yōu)化的破乳率為90.76%。此外，Campbell等[2]也對乳狀液進(jìn)行了加熱破乳研究，其將乳狀液在95 ℃下加熱30 min，也達(dá)到了初步破乳的效果。近年來，許多學(xué)者對乳狀液的破乳技術(shù)進(jìn)行了研究，但對乳狀液結(jié)構(gòu)特征的研究并不透徹。

因此，本研究在用不同溫度熱處理大豆乳狀液中，通過ζ-電位、粒徑分布、顯微觀察分析乳狀液的穩(wěn)定性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜分析蛋白質(zhì)變化，明確不同熱處理溫度大豆乳狀液結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性之間的構(gòu)效關(guān)系，探究乳狀液體系中各組分的分子間作用力和組成以及空間構(gòu)象。從而開發(fā)新型、高效的破乳技術(shù)，為生物解離提取大豆油脂產(chǎn)業(yè)化提供理論參考及應(yīng)用指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；Protex 6L堿性蛋白酶 杰能科生物工程有限公司；SDS、β-巰基乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉鹽酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白、氫氧化鈉、丙酮、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī) 紹興科宏儀器有限公司；擠壓膨化機(jī) 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；LGJ-1冷凍干燥機(jī)上海醫(yī)用離心機(jī)廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀、Mastersizer 2000粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；TNZ1-5700傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；F2000熒光光譜儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離大豆乳狀液的制備

參照齊寶坤[6]的方法并適當(dāng)修改。大豆粉碎后擠壓膨化預(yù)處理，得到膨化大豆粉。膨化大豆粉與水混合（料液比1∶6），加入Protex6L堿性蛋白酶，攪拌均勻后在60 ℃水浴鍋中保持恒溫加熱，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，酶解3 h后取出，于100 ℃沸水中滅酶10 min，在4 500 r/min下離心20 min，吸取游離油，將其余液體部分倒入分液漏斗，靜置24 h分層，將乳狀液分離。

1.3.2 乳狀液的熱處理

稱取20 g酶解后的原始乳狀液，分別在不同的溫度條件（55、65、75、85、95 ℃）下加熱1 h，然后在3 585 r/min離心10 min，分離乳狀液和水相。

1.3.3 乳狀液分層系數(shù)和游離油得率的測定

取8 mL處理后的乳狀液于離心管中，在4 ℃貯藏24 h，乳狀液發(fā)生分層現(xiàn)象，上相渾濁、下相澄清。分層系數(shù)、游離油得率的計(jì)算分別見公式（1）、（2）。

1.3.4 乳狀液粒徑及ζ-電位的測定

采用激光光散射粒度儀測定乳狀液體積平均粒徑（D4,3）和表面積平均粒徑（D3,2），將小部分乳狀液分散在50 mL蒸餾水中，保持粒徑數(shù)值在測定范圍內(nèi)，大豆油滴的折射指數(shù)（refractive index，RI）為1.470，分散劑的RI為1.333。

采用Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀測定乳狀液溶液的ζ-電位。用0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將大豆乳狀液樣品稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液后進(jìn)行測定，上樣體積1 mL，測定溫度25 ℃。每個樣品重復(fù)測量3 次。

1.3.5 乳狀液激光共聚焦顯微鏡觀察

采用Ar/K和He/Ne雙通道激光模式，激發(fā)光的波長分別是488 nm和633 nm。分別將0.01 mg/mL尼羅紅和0.01 mg/mL尼羅藍(lán)溶解在異丙醇中，制成染色液。取1 mL乳狀液樣品，分別加入400 μL 0.01 mg/mL尼羅紅染色液和尼羅藍(lán)染色液，混合均勻后染色20 min，取1 滴染色后的乳狀液樣品置于帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。采用油鏡進(jìn)行圖像的采集，分辨率為1 024h1 024，圖像采集的范圍為5～45 μm。

1.3.6 乳狀液流變的測定

采用流變儀測定乳狀液的流變學(xué)變化。剪切速率為5 s－1，升溫速率為5 ℃/min，觀察此時乳狀液的黏度隨溫度的變化規(guī)律。在25 ℃下，采用流變儀觀察黏度隨剪切速率的變化規(guī)律。在線性黏彈區(qū)域內(nèi)，測定乳狀液樣品的彈性模量G′隨振蕩頻率的變化規(guī)律。選擇平行板測試系統(tǒng)，其平行板的間距為1 mm，直徑為40 mm[7]。

1.3.7 乳狀液中蛋白質(zhì)的提取

乳狀液水相中蛋白質(zhì)提取采用丙酮沉淀法[8]，用冰丙酮按照20 g/L在－18 ℃下反應(yīng)2 h，4 ℃ 12 000hg離心分離15 min，除去上清液，將沉淀繼續(xù)用冷丙酮洗滌4～5 次，直到溶劑由黃色變成無色，沉淀中溶劑揮發(fā)后凍干得到蛋白，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.8 SDS-PAGE分析

乳狀液的處理參照文獻(xiàn)[9]的方法，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，上樣質(zhì)量濃度1 mg/mL，上樣量為10 μL，上樣前將樣品先在95 ℃下加熱5 min。初始電流為10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后改為20 mA。分離后先染色再脫色。

1.3.9 表面疏水性的測定

依據(jù)Laemmli[10]的方法，采用8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）熒光探針法。稱取0.025 g不同處理方式下的蛋白樣品溶于50 mL磷酸鹽緩沖液中，配成pH 7、0.01 mol/L的溶液，將溶液在室溫下攪拌混合1 h，然后在10 000hg下離心30 min，取上清液采用Lowry法測定其蛋白質(zhì)濃度，并用上述磷酸鹽緩沖液依次稀釋后，使其濃度在0.005～0.500 mol/mL之間。取不同濃度樣品溶液4 mL，分別加入40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液，經(jīng)振蕩混合后靜置5 min，再測定樣品的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長為490 nm，夾縫寬度為5 nm。對熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

1.3.10 傅里葉變換紅外光譜分析

將樣品粉碎后過100 目篩，粉末在40 ℃烘箱中烘干12 h，然后在紅外燈下進(jìn)行研磨處理。稱取約2 mg待測樣品，加入200 mg溴化鉀，在瑪瑙研缽中研磨15 min，隨后進(jìn)行壓片處理，壓片機(jī)在14 kg壓力下約保持1 min，然后將制得的均勻透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行測定。測定的條件為：掃描范圍400～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1，掃描信號累加64 次。每個樣品重復(fù)3 次。

譜圖的分析處理采用Peakfit軟件，在酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）進(jìn)行兩點(diǎn)基線校正，然后再采用Savitsk-Go1ay函數(shù)進(jìn)行平滑處理，求二階導(dǎo)數(shù)，并采用Gauss峰形進(jìn)行擬合，估算出子峰的個數(shù)與位置，經(jīng)過手動調(diào)整各子峰的峰高和半峰寬進(jìn)行多次擬合使得殘差最小，確定各子峰與各二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系后，根據(jù)其積分面積計(jì)算出4 種二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.11 熒光光譜分析

依據(jù)尹壽偉[11]的方法，采用F2000熒光光譜議測定乳狀液分離出的大豆蛋白的色氨酸熒光光譜。將大豆蛋白樣品分別分散于0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。熒光發(fā)散光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為了降低酪氨酸的貢獻(xiàn)，熒光光譜的激發(fā)波長為290 nm，光譜的掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬度均為5 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3 次平行，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用SPSS 18軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理溫度下乳狀液分層系數(shù)和游離油得率分析

圖1 不同溫度下乳狀液的分層系數(shù)和游離油得率Fig.1 Creaming index and free oil yield of the emulsion treated at different temperatures

如圖1所示，隨著熱處理溫度的升高，分層系數(shù)和游離油得率呈增加趨勢。當(dāng)熱處理溫度為85 ℃以上時，分層系數(shù)和游離油得率明顯增加。加熱溫度為95 ℃時，分層系數(shù)和游離油得率達(dá)到最大，分別為42%和81%左右。大豆乳狀液的失穩(wěn)是熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)受熱變性引起油滴聚集導(dǎo)致的。大豆中的蛋白質(zhì)對乳狀液的穩(wěn)定起著重要的作用，高溫加熱能夠使蛋白質(zhì)變性。Kwon等[12]的研究表明，大豆乳狀液中蛋白質(zhì)在80 ℃以上會發(fā)生變性和凝聚。乳狀液中蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性會使油滴表面電荷降低，具有低表面電荷的油滴相互靠近導(dǎo)致乳狀液分層，油滴聚集形成大油滴。由于聚集形成大油滴和施加的外力離心力的作用，會使乳狀液破乳，導(dǎo)致相分離形成油層和水層[13]。因此，熱處理溫度超過85 ℃時會使大多數(shù)蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致乳狀液破乳并釋放出油脂。

2.2 不同熱處理溫度下乳狀液ζ-電位分析

圖2 不同熱處理溫度下乳狀液ζ-電位（A）、粒度分布（B）與平均粒徑（C）的變化Fig.2 Zeta potential (A), particle size distribution (B) and average particle size (C) of the emulsion treated at different temperatures

如圖2所示，乳狀液ζ-電位在75 ℃以下時沒有明顯變化，粒度分布呈單峰，主要分布在0.5～100 μm。當(dāng)加熱到85 ℃時，乳狀液ζ-電位明顯增加，在10～100 μm范圍分布的液滴明顯增多。95 ℃熱處理乳狀液ζ-電位最大，粒度分布峰向大粒徑方向移動，并且在大于100 μm的粒徑區(qū)域也有少量的分布，平均粒徑達(dá)到最大，其D4,3值為（14.79±0.64）μm，并且發(fā)生絮凝作用，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低，而D3,2值變化不明顯。ζ-電位的變化表明乳狀液周圍界面層的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些改變[14]。一般來說，球蛋白穩(wěn)定的乳狀液易受熱處理溫度等不穩(wěn)定因素的影響，大多數(shù)球蛋白容易發(fā)生熱誘導(dǎo)變性[15]。此外，高溫還會破壞乳狀液界面層的組成和結(jié)構(gòu)，使油脂體表面電荷減少，液滴之間的靜電相互作用增大。通過靜電相互作用產(chǎn)生的吸引力能夠引起液滴的凝沉和聚集，導(dǎo)致乳狀液粒徑增大。然而，Chiang等[16]發(fā)現(xiàn)其他植物來源的天然或人造乳狀液具有較好的熱穩(wěn)定性，這表明對球蛋白穩(wěn)定油滴形成的乳狀液進(jìn)行熱處理后，不會引起乳狀液表面性質(zhì)的顯著改變。Nikiforidis等[17]對玉米胚芽乳狀液的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果與本研究不同，他發(fā)現(xiàn)對玉米胚芽乳狀液進(jìn)行熱處理后其粒徑變化不顯著，這可能與熱處理溫度低于70 ℃有關(guān)。本研究的熱處理溫度設(shè)置在55～95 ℃，當(dāng)加熱到85 ℃和95 ℃時，溫度高于油脂體蛋白的變性溫度（60～75 ℃），乳狀液ζ-電位與D4,3值才發(fā)生顯著變化，破壞了界面層的組成和結(jié)構(gòu)，使油脂體表面電荷急劇減少，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。

2.3 不同熱處理溫度下乳狀液激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果

圖3 不同熱處理溫度下乳狀液的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果Fig.3 Confocal laser scanning microscopic images of the emulsion treated at different temperatures

乳狀液的液滴分布、形態(tài)以及微觀結(jié)構(gòu)變化可以直接由激光共聚焦顯微鏡觀察。從圖3中可以看出紅色的油相和綠色的蛋白相的分布情況，熱處理溫度對乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)具有顯著影響。當(dāng)熱處理溫度為55～75 ℃時沒有破壞乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，油滴尺寸和分布情況沒有顯著改變；當(dāng)熱處理溫度達(dá)到85～95 ℃時，油滴尺寸明顯增加，出現(xiàn)了更多的大油滴，且部分蛋白質(zhì)受熱形成聚集體，這說明高溫破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小油滴聚集形成大油滴。這可能與蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)，加熱溫度達(dá)到85 ℃以上后，能夠使乳狀液中大部分蛋白質(zhì)變性，從而使蛋白質(zhì)失去原有的乳化能力，破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致油滴聚集。因此，對乳狀液進(jìn)行85 ℃以上的熱處理可以有效破壞乳狀液的穩(wěn)定體系，進(jìn)而達(dá)到回收油脂的目的。

2.4 不同熱處理溫度下乳狀液的流變性分析

圖4 不同溫度下乳狀液黏度與剪切速率的關(guān)系Fig.4 Correlation between viscosity and shear rate of the emulsion treated at different temperatures

由圖4可知，隨著剪切速率的增加，所有熱處理溫度條件下乳狀液的黏度逐漸降低，最終達(dá)到平衡，表現(xiàn)為剪切變稀的性質(zhì)，為典型的假塑性流體。在低剪切速率下，乳狀液黏度急劇下降；在高剪切速率下，乳狀液黏度幾乎沒有變化，這與原始乳狀液的變化趨勢（未在圖中顯示）相似。熱處理溫度為55 ℃的乳狀液黏度隨著剪切速率的增加下降得最慢，且最終黏度最大。隨著熱處理溫度的升高，乳狀液黏度下降速率逐漸加快，且最終黏度也逐漸降低，表明剪切變稀行為加劇。在熱處理溫度為55～75 ℃時這種變化不明顯，而當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃和95 ℃時，乳狀液黏度下降速率明顯增加，最終黏度明顯下降。這說明高溫處理導(dǎo)致乳狀液剪切變稀行為加劇，降低了乳狀液的黏度，乳狀液黏度的降低促進(jìn)了液滴的移動，使小液滴易于聚集成大液滴，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性下降[18]。此外，這也可能與超過85 ℃的高溫處理促使乳狀液中蛋白質(zhì)變性有關(guān)。因此，對乳狀液進(jìn)行高溫處理可以達(dá)到破乳的目的。

2.5 不同熱處理溫度乳狀液中的蛋白質(zhì)特性分析

2.5.1 不同熱處理溫度下乳狀液表面疏水性分析

圖5 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of the emulsion treated at different temperatures

蛋白質(zhì)分子重要的表觀特征之一就是疏水性，蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)的變化可以由表面疏水性反映，這也是反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的一個重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)多肽鏈的展開、亞基的解離等都可以導(dǎo)致其表面疏水性的增加，而蛋白質(zhì)聚集形成的可溶性或不可溶性聚集體會導(dǎo)致其表面疏水性的降低。如圖5所示，熱處理會使乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性降低。熱處理溫度由55 ℃升高到95 ℃，乳狀液中蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)由（292.40±5.06）降低至（146.60±4.95）。Sorgentini等[19]對熱處理過程中大豆分離蛋白表面疏水性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)熱處理會使蛋白質(zhì)多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)伸展，暴露出埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性升高，這與本研究中得到的熱處理會使乳狀液蛋白質(zhì)表面疏水性降低的結(jié)果有所不同。其原因可能是由于乳狀液經(jīng)過熱處理后，蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性而暴露出內(nèi)部的疏水殘基，亞基之間通過疏水相互作用而發(fā)生聚集，形成可溶性或不可溶性的聚集體，這些聚集體會對蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域產(chǎn)生屏蔽作用，阻礙了疏水基團(tuán)與熒光探針ANS的有效結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性下降[20]。此外，乳狀液由55 ℃升高到75 ℃過程中，蛋白質(zhì)的表面疏水性變化不明顯，當(dāng)溫度超過85 ℃后，其表面疏水性明顯降低，在95 ℃時降至最低，這可能與85 ℃超過了乳狀液中蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)。當(dāng)處理溫度超過蛋白質(zhì)變性溫度時，蛋白質(zhì)會發(fā)生明顯的熱聚集，引起其表面疏水性的明顯降低。

2.5.2 不同熱處理溫度下的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖6 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE patterns of proteins in the emulsion treated at different temperatures

SDS-PAGE常用于蛋白質(zhì)亞基組成和結(jié)構(gòu)的分析，是蛋白質(zhì)亞基常用的檢測手段[21]。由圖6可知，乳狀液中蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量主要分布在11～63 kDa，在分子質(zhì)量小于11 kDa處還分布一部分小分子質(zhì)量亞基。熱處理溫度為55 ℃的乳狀液蛋白亞基主要分布在11、20 kDa和35～48 kDa處；當(dāng)熱處理溫度升高到65 ℃時，分子質(zhì)量為20 kDa的亞基消失了，這可能是由于20 kDa的亞基對熱敏感，熱處理導(dǎo)致其分解造成的[22]。75 ℃和65 ℃熱處理的乳狀液蛋白的亞基分布幾乎沒有差別，當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃時，在35～48 kDa處分布的亞基分子質(zhì)量增大；在95 ℃時亞基分子質(zhì)量增大得更明顯，這可能是由于高溫處理使乳狀液中蛋白質(zhì)亞基聚集，導(dǎo)致分子質(zhì)量的增大[23]。85 ℃以上熱處理溫度達(dá)到了乳狀液蛋白的變性溫度，蛋白質(zhì)會發(fā)生熱變性聚集，導(dǎo)致其分子質(zhì)量增大，這也與本研究中熱處理對乳狀液穩(wěn)定性影響的分析結(jié)果相符。

2.5.3 不同熱處理溫度下傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖7 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 Fourier transform infrared spectra of proteins in the emulsion treated at different temperatures

傅里葉變換紅外光譜數(shù)據(jù)能夠揭示蛋白質(zhì)在特定環(huán)境中的二級結(jié)構(gòu)信息。由圖7可知，乳狀液由55 ℃加熱到95 ℃過程中，蛋白質(zhì)的傅里葉變換紅外光譜發(fā)生明顯改變。隨著熱處理溫度的升高，乳狀液中蛋白質(zhì)的紅外特征吸收峰強(qiáng)度逐漸增加，在加熱到75 ℃以上時吸收峰增加明顯。這些吸收峰位置為C—O—C鍵伸縮振動產(chǎn)生吸收峰的1 000～1 260 cm－1處，芳香族中C—H鍵彎曲振動產(chǎn)生吸收峰的1 400～1 600 cm－1處[24]，üCH3和—CH2基團(tuán)中C—H伸縮振動產(chǎn)生吸收峰的2 800～3 000 cm－1處[25]，—OH基伸縮振動產(chǎn)生吸收峰的3 300 cm－1附近[26]。

表1 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量Table1 Secondary structure contents of proteins in the emulsion treated at different temperatures

原始乳狀液的二級結(jié)構(gòu)組成為：α-螺旋含量（17.3±0.1）%、β-折疊含量（40.9±0.2）%、β-轉(zhuǎn)角含量（18.4±0.1）%、無規(guī)卷曲含量（23.4±0.1）%。由表1可知，乳狀液經(jīng)熱處理后其蛋白質(zhì)α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，β-轉(zhuǎn)角含量變化不顯著，無規(guī)卷曲含量增加，且這種變化趨勢隨著熱處理溫度的升高而更加明顯。這說明乳狀液經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，這可能是蛋白質(zhì)受熱變性導(dǎo)致的[27]。隨著熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)的熱變性程度進(jìn)一步增加，導(dǎo)致更多的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，體現(xiàn)為α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)卷曲含量增加。然而，熱處理溫度超過85 ℃以后，乳狀液中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量變化不顯著（P＞0.05），這可能與蛋白質(zhì)已經(jīng)完全變性有關(guān)。Chakraborty等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在受熱變性時，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量會減少，β-折疊結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量會增加。Kim等[29]發(fā)現(xiàn)熱處理能夠使β-乳球蛋白乳狀液發(fā)生巰基-二硫鍵轉(zhuǎn)換。Zhai Jiali等[30]發(fā)現(xiàn)在76 ℃下對β-乳球蛋白乳狀液進(jìn)行熱處理，其發(fā)生了構(gòu)象改變，但是這種構(gòu)象改變沒有溶液中蛋白質(zhì)的變化明顯，與本研究結(jié)果一致。

2.5.4 不同熱處理溫度下色氨酸內(nèi)源熒光光譜分析

圖8 不同熱處理溫度下乳狀液中蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜圖（A）、熒光強(qiáng)度和最大吸收波長（B）Fig.8 Intrinsic fl uorescence spectra (A), fl uorescence intensity and λmax (B) of the protein in the emulsion treated at different temperatures

在色氨酸內(nèi)源熒光光譜中，光能夠在90°入射角使樣品成為激發(fā)態(tài)。當(dāng)大量的光被乳狀液吸收或發(fā)散，探測器能夠檢測到很弱的熒光信號。設(shè)定入射角在30°～60°之間，一部分光能夠反射到檢測器中獲得較強(qiáng)的光信號[31]。色氨酸熒光光譜已被普遍用于研究乳狀液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[32]。由圖8可知，乳狀液由55 ℃加熱到95 ℃過程中，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度由（373.1±8.3）逐漸降低至（201.8±6.2），發(fā)生了熒光猝滅作用，這可能是由于熱處理過程中蛋白質(zhì)色氨酸殘基周圍微環(huán)境變化導(dǎo)致的[33]。最大吸收波長（λmax）與熒光強(qiáng)度的變化趨勢相反，隨著熱處理溫度由55 ℃升高到95 ℃，蛋白質(zhì)的λmax逐漸增大，由（343.8±0.2）nm增大到（348.7±0.2）nm，即λmax發(fā)生紅移。乳狀液由55 ℃升高到75 ℃，蛋白質(zhì)的λmax變化不明顯，當(dāng)溫度超過85 ℃后，λmax發(fā)生明顯紅移，這可能與85 ℃超過了乳狀液中蛋白質(zhì)的變性溫度有關(guān)。當(dāng)熱處理溫度超過蛋白質(zhì)的變性溫度后，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展，暴露出原本埋藏在內(nèi)部的疏水基團(tuán)，使色氨酸殘基周圍環(huán)境的極性增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變。當(dāng)溫度達(dá)到95 ℃時，蛋白質(zhì)完全變性，使蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)更多的暴露到分子表面，且λmax紅移程度增加，此時蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變得更加松散。晏華立等[34]對麻瘋樹核糖體失活蛋白（curcin）熒光光譜的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度高于curcin的變性溫度時，可能導(dǎo)致curcin中色氨酸殘基的疏水核心結(jié)構(gòu)出現(xiàn)暴露在外的變性過程，引起色氨酸的特征吸收峰紅移，這與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究通過生物解離技術(shù)提取大豆乳狀液，探討不同熱處理溫度（55、65、75、85、95 ℃）對乳狀液穩(wěn)定性的影響，從宏觀到微觀逐步探究了乳狀液體系中各組分的分子間作用力、組成以及空間構(gòu)象，得到主要結(jié)論如下：1）隨著溫度的增加，乳狀液的ζ-電位、平均粒徑和黏度均增加，95 ℃熱處理時油滴尺寸明顯增加，出現(xiàn)了更多的大油滴，這說明高溫破壞了乳狀液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致小油滴聚集形成大油滴；2）熱處理溫度低時，乳狀液蛋白的亞基分布幾乎沒有差別，當(dāng)熱處理溫度升高到85 ℃時亞基分子質(zhì)量增大，在溫度為95 ℃時亞基分子質(zhì)量增大更明顯，說明乳狀液經(jīng)熱處理后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，且這種變化趨勢隨著熱處理溫度的升高而更加明顯；3）隨著熱處理溫度的升高，蛋白的熒光強(qiáng)度降低，發(fā)生了熒光猝滅作用，乳狀液的游離油得率升高。