阿衣古麗g阿力木，宋煥祿*，劉 野，鄒婷婷，張 雨，張松培

（北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048）

酵母抽提物（yeast extract，YE）既是強鮮味劑，又是風味增強劑。因此，在各類食品及食品原料的生產加工過程中添加YE后，應適當減少及調整原配方中其他食品添加劑（如肌苷酸（inosine acid，IMP）＋鳥苷酸（guanine nucleotide，GMP）、味精、水解植物蛋白液和水解動物蛋白）的用量。這些滋味活性物質賦予食品鮮味、苦味、甜味、酸味等基本味及近期發(fā)現(xiàn)的濃厚味。在起初的滋味研究中，因為沒有找到鮮味的味覺受體，因此鮮味并沒有被算作是基本味。2000年Chaudhari[1]和Nelson[2]等找到了鮮味的受體——谷氨酸（Glu）的G蛋白偶聯(lián)受體（例如mGluR4和異源性T1R1＋3受體），這一發(fā)現(xiàn)具有里程碑式的作用。一般推測鮮味的代表物質是L-Glu和其他一些L型氨基酸，這些鮮味氨基酸反映了食品中另一個不可或缺的營養(yǎng)素——蛋白質的含量[3]。在YE中氨基酸、核苷酸、硫胺素、還原糖以及多肽類化合物也是滋味化合物，這些化合物在加熱過程中發(fā)生美拉德反應。熱反應產物中有大量的滋味活性物質。其中Festring等利用反相高效液相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）-串聯(lián)質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）法測定YE中的4 種核苷酸，發(fā)現(xiàn)IMP、GMP對鮮味具有提升作用[4]。肽及美拉德反應產物因具有獨特的滋味活性而被關注。

鮮味是最近被人們認可的一種基本味，隨著對鮮味肽的深入探究，有學者對含有Glu殘基的12 種二肽，如Glu-Asp、Glu-Ser、Glu-Thr和Glu-Glu等進行感官研究，發(fā)現(xiàn)在C-端疏水性較小的氨基酸的二肽具有肉湯鮮味。有研究報道，一些鮮味肽本身的鮮味可能不明顯，但與谷氨酸單鈉鹽、GMP、IMP、食鹽等共同存在時可以促進其產生鮮味或使鮮味變得更加強烈，稱為鮮味增強肽[5-6]。Maehashi等[7]從雞胸肉提取出6 種對鮮味提升具有明顯效果的鮮味提升肽，其中Glu-Glu、Glu-Val兩種肽本身也具有鮮味。Han Fuliang等[8]在黃酒中發(fā)現(xiàn)了一種三肽，僅由Glu組成且具有鮮味。Su Guowan等[9]從花生中提取到一種鮮味增強肽和一種鮮味肽。

Hofmann等運用凝膠滲透色譜、HPLC-MS/MS技術結合感官評價手段，對成熟期為44 周的Gouda干酪中的水溶性物質進行了研究[10]。Toelstede等應用感官組學對Gouda干酪的風味進行了深入研究，他們運用凝膠滲透色譜、超濾技術、RP-HPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-飛行時間（time of fl ight，TOF）-MS/MS對干酪中水溶性提取物中的苦味成分進行了鑒定，其中16 種苦味肽被鑒定出來，12 個肽具有較強的苦味[11]。Schlichtherle-Cerny等采用多種蛋白酶復合酶酶解小麥面筋蛋白，得到了去氨基的小麥面筋水解物，然后用凝膠滲透色譜、RP-HPLC、HPLC-MS/MS結合滋味分析對其進行分析，結果表明pGlu-Pro-Ser、pGlu-Pro、pGlu-Pro-Glu、pGlu-Pro-Gln具有滋味活性，是水解液中的滋味活性化合物[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，熱反應后大分子肽降解生成小分子肽，分子質量小于1 000 Da的組分含量顯著下降，降解成小分子肽段和游離氨基酸[13]。

本實驗使用不同溫度熱處理后的YE，測定具鮮味的氨基酸和核苷酸的濃度變化趨勢；然后結合電子舌數據分析出鮮味最強的樣品及溫度對樣品鮮味的影響；將鮮味最強的樣品進一步采用超濾、凝膠過濾、RP-HPLC等技術分離純化出具有鮮味的肽段，利用超高效液相色譜-四極桿-TOF-MS/MS（ultraperformance liquid chromatography-quadrupole-TOF-MS/MS，UPLC-Q-TOF-MS/MS）對目標肽分子進行打碎，結合肽鏈的斷裂規(guī)律，人工解析出目標肽的氨基酸序列。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核苷酸標準品、氨基酸標準品、9-氟甲基氯甲酸甲酯的乙腈溶液（9-f l uorenylmethylchloroformate in acetonitrile，F(xiàn)OMC）試劑、含鄰苯二甲醛和3-巰基丙酸的硼酸緩沖液（O-phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid in borate buffer，OPA）試劑、硼酸鹽試劑 美國安捷倫科技有限公司；其他相關標準品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國賽默飛世爾公司；酵母膏安琪酵母股份有限公司；超純水由分子感官科學實驗室自制；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1200型HPLC、1290型UPLC、Q-TOF-MS/MS美國安捷倫科技公司；?KTA快速純化系統(tǒng) 美國通用電氣公司；Asrree II/LS16型電子舌 法國Alpha MOS公司；LB-32型冷凍干燥機 美國賽默飛世爾公司；切向流超濾系統(tǒng) 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 YE的制備

設置不同的熱反應溫度（100、110、120、130、140 ℃），取0.1 g酵母膏加入1 mL超純水中，錫箔紙密封，置于高壓反應釜中反應1 h后，過0.22 μm微孔濾膜，放置于4 ℃冰箱中待測。以未經處理的YE為對照組（CK）。

1.3.2 YE中氨基酸含量的檢測

結合HPLC技術，采用錢敏等[14]的方法檢測鮮味氨基酸，采用柱前衍生法對樣品中的4 種游離氨基酸（天冬氨酸（Asp）、Glu、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala））進行定量分析。將氨基酸混合標準品（1 nmol/μL）用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成不同濃度（0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 nmol/μL）的混合標準品作標準曲線，采用外標法定量。

HPLC條件：色譜柱：Zorbax Eclipse-AAA（150 mmh4.6 mm，5 μm）；流動相：水相A為0.04 mol/L NaH2PO4溶液（pH 7.8），有機相B為甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）；梯度洗脫程序：0 min，0%流動相B；1.9 min，0%流動相B；18.1 min，37%流動相B；23.2 min，37%流動相B；24 min，100%流動相B；26 min，100%流動相B；27 min，0%流動相B；30 min，0%流動相B。流速：1 mL/min；進樣方式：程序進樣；進樣量：1 μL；紫外檢測波長：338 nm；柱溫：40 ℃。

自動進樣程序：從瓶1（硼酸）中抽取2.5 μL，從樣品瓶中抽取0.5 μL，將3.0 μL溶液以最大速率混合2 次，等待0.5 min；在瓶2（超純水）中清洗進樣針；從瓶3（OPA）中抽取0.5 μL，將3.5 μL以最大速率混合6 次；在瓶2（超純水）中清洗進樣針；從瓶4（FOMC）抽取0.5 μL，將4.0 μL以最大速率混合6 次；從瓶5（超純水）中抽取18 μL，將32 μL以最大速率混合2 次；進樣。

1.3.3 YE中核苷酸的檢測

5’-核苷酸鈉鹽是重要的滋味活性物質，采用HPLC技術檢測YE中5’-核苷酸鈉鹽含量，測定方法為：取3 mL樣品，超聲5 min，過0.22 μm濾膜，置于4 ℃冰箱備用。色譜柱柱溫控制為20 ℃，流動相為0.20 mol/L KH2PO4溶液，用磷酸調節(jié)pH值為3.8，進樣量1 μL，流速1 mL/min。通過5’-核苷酸標準品稀釋液作標準曲線進行定量[15]。

分別稱取5’-腺苷酸（adenine nucleotide，AMP）、5’-IMP、5’-腺苷酸（cytosine nucleotide，CMP）和5’-GMP 4 種核苷酸各8 mg，定容到10 mL，依次稀釋6 個質量濃度梯度（800、400、200、100、40、8 mg/L），做4 種核苷酸的標準曲線，采用外標法定量。

1.3.4 YE中肽分布的測定

為了確定YE在加熱過程中的肽分布變化情況，采用HPLC法，使用質量濃度均為2 mg/mL的桿菌肽（Mr＝1 422.69 Da）、FFEFVT（Phe-Phe-Glu-Phe-Val-Thr）多肽（Mr＝789.88 Da）、Glu-Ser-Glu-Cys-Gly（Mr＝448.45 Da）、谷胱甘肽（Mr＝307 Da）、Gly（Mr＝75.07 Da）做分子質量標準曲線[16]。以相對分子質量的對數對保留時間作圖得到分子校正曲線及其方程。取3 g YE溶于1 mL超純水中，經過一定溫度熱處理，用0.22 μm濾膜過濾，并取1 mL于液相小瓶中備用。流動相采用體積分數20%乙腈-水溶液，用甲酸調節(jié)pH值為3.0。流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為220 nm，進樣量為1 μL。

1.3.5 YE的滋味分析

采用Asrree型電子舌系統(tǒng)（主要由傳感器陣列、自動進樣器、數據采集系統(tǒng)以及電子舌配套的數據分析軟件組成）。傳感器陣列由7 個具有化學選擇性區(qū)域效應的味覺傳感器和1 個Ag/AgCl參比電極組成。這7 個傳感器對酸、甜、苦、咸、鮮5 種基本味覺呈味物質都有響應。將處理好的樣品放置在設定好的位置上，通過自動進樣器使傳感器和電極都與樣品接觸，根據傳感器接觸樣品的電勢（V）與參比電極（Ag/AgCl）的電勢（V0）的差值進行數據處理和模式識別[17-18]。本實驗只檢測酸味、鮮味和咸味的強度。

1.3.6 YE中鮮味肽的分離純化

選取鮮味最強的樣品進行冷凍干燥，然后取40 g樣品溶于200 mL超純水。分別用截流分子質量不低于5 000 Da、3 000～1 000 Da和不超過1 000 Da的超濾膜包截流樣品溶液，重復多次進行。分別合并多級截留液和透出液，冷凍干燥，用電子舌測定樣品鮮味的強度，置于－20 ℃?zhèn)溆肹19]。

經過超濾后得到不同分子質量的樣品粗組分，取鮮味最強的組分0.1 g溶于3 mL超純水中備用。使用蛋白純化儀對不同粗組分進一步的分離純化[20-21]，凝膠色譜柱用超純水先經過預平衡和活化，接著用體積分數1%甲酸溶液調整pH值為4，用超純水再次平衡凝膠柱。儀器洗脫條件為：流動相為超純水，用體積分數1%甲酸溶液調整pH值為4.0；紫外檢測波長：220 nm，流速：0.6 mL/min；分次進樣，每次進樣量為500 μL，合并相同組分，冷凍干燥后溶解并進行感官評價。

將經過凝膠分離后的滋味活性組分溶解，采用XDB-C18柱進一步分離鮮味肽段組分[22]，以甲醇和水為流動相，紫外檢測波長：220 nm，流速5 mL/min，進樣量1 000 μL，根據色譜峰收集相關組分，冷凍干燥后溶解并進行感官評價。

1.3.7 UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定肽序列結構

取一定量經過RP-HPLC分離的滋味活性組分采用超純水溶解，使用Eclipse Plus C18色譜柱，以含體積分數0.1%甲酸的甲醇溶液作為流動相A，體積分數0.1%甲酸溶液作為流動相B，設置流速為0.2 mL/min，進樣量為1 μL，柱溫調整為30 ℃。MS條件為：正離子模式；毛細管電壓：3 500 V；噴嘴電壓：500 V；霧化壓力：241 kPa；干燥器溫度：300 ℃；流量：5 L/min；載氣（N2）溫度：150 ℃；流量：1 L/min；流速：0.2 mL/min；碰撞能：20 eV；離子掃描范圍：m/z 50～1 000[23]。通過肽鍵兩端斷裂的碎片鑒定鮮味肽段的序列[24]。

1.3.8 感官評價

味道是人們評估食物可口性的重要指標，是由舌頭的味蕾細胞呈現(xiàn)出的化學反應。基本味覺分為酸、甜、苦、鮮、咸5 種。在實驗過程中，組織實驗室感官評價小組（男性4 名、女性6 名）；感官評價員評價前用標準溶液進行培訓：蘸取適量甜味（35 mmol/L蔗糖溶液）、酸味（1.5 mmol/L酒石酸溶液）、咸味（40 mmol/L NaCl溶液）、鮮味（10 mmol/L谷氨酸單鈉鹽溶液）、苦味（15 mmol/L奎寧溶液）以及5 種溶液的混合液進行品嘗訓練。制備好樣品后，組織感官評價小組對樣品進行感官評價，對成品液進行打分（10 分制：0～2 分，很弱；3～4 分，弱；5～6 分，中等；7～8 分，強；9～10 分，很強）。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析（單因素方差分析），P＜0.05表示差異顯著；使用Origin 8.0軟件作圖。電子舌數據采用主成分分析法進行分析[25]，根據所得數據建模，相近的數據歸為一類或一組[26]。每個樣品進行5 次測試，驗證滋味的差異。

2 結果與分析

2.1 YE經不同溫度熱處理后鮮味氨基酸含量的變化

游離氨基酸中，Glu、Ala、Gly及Asp呈鮮味[27]。氨基酸混合標準品標準曲線的線性回歸方程如表1所示。

表1 氨基酸混合標準品標準曲線的線性回歸方程Table1 Linear regression equation for amino acids

圖1 YE經不同溫度處理后鮮味氨基酸含量的變化Fig.1 Changes in umami amino acids in YE at different temperatures

由圖1可以看出，隨著加熱溫度的升高，YE中的鮮味氨基酸含量有所變化。Glu、Asp、Gly和Ala的含量先下降，在加熱溫度達到120 ℃后開始上升，由于加熱過程中前驅物肽的分布也有所變化，因此可能是肽降解變成氨基酸，影響了氨基酸含量的變化。

2.2 YE經不同溫度熱處理后核苷酸含量的變化

YE中核苷酸主要包括4 種，以核苷酸二鈉鹽的形式存在，包括5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP和5’-GMP，其中5’-IMP、5’-GMP是重要的滋味活性物質[28]。核苷酸類也會參與熱反應，例如肉中的核苷酸（如肌苷單磷酸鹽）加熱后產生5-磷酸核糖，經過脫磷酸、脫水形成5-甲基-4-羥基-呋喃酮。羥甲基呋喃酮類化合物很容易與硫化氫反應，產生噻吩類化合物和呋喃類化合物，并產生非常強烈的氣味[29]。

圖2 YE經不同溫度處理后核苷酸含量的變化Fig.2 Changes in nucleotides in YE at different temperatures

如圖2所示，樣品在100～140 ℃加熱過程中，4 種核苷酸的平均含量均呈快速下降的趨勢，5’-IMP初始含量為0.733 g/kg，當溫度升高到140 ℃時下降到0.155 g/kg；5’-GMP從初始含量0.745 g/kg降低到0.17 g/kg。

2.3 YE經不同溫度熱處理后肽分布的變化

圖3 YE經不同溫度處理后肽分布的變化Fig.3 Changes in peptide components in YE at different temperatures

從圖3可以看出，隨著加熱溫度的升高，分子質量大于1 000 Da以及500～1 000 Da的組分含量逐漸降低，而300～500 Da以及小于300 Da的組分含量逐漸升高，說明在加熱過程中大分子肽類逐漸降解成小分子肽類，且大部分為單個氨基酸或小于五肽的組分，這些化合物作為前驅物又可參與到熱反應過程中，形成香氣活性化合物。

2.4 YE經不同溫度熱處理后滋味的變化

圖4 YE經不同溫度處理后滋味的變化Fig.4 Taste prof i les of YE at different temperatures

如圖4A所示，所有的樣品都有強烈的酸味，CK組有較強的鮮味，隨著處理溫度的升高，YE的鮮味明顯下降。隨著溫度的升高，小肽繼續(xù)參與反應，分子質量大的肽降解為分子質量較小的肽，形成新的肽段。當溫度達到110 ℃時鮮味最強，而在140 ℃時鮮味較低。對數據矩陣進行主成分分析，圖4B顯示不同樣品的電子舌傳感器信號得分圖。PC1和PC2的方差貢獻率分別為93.94%、6.05%。CS組能被PC1與其他樣品清楚的區(qū)分。PC2使100、110 ℃和120 ℃處理組的樣品明顯在不同位置，130 ℃和140 ℃處理組的樣品分布在圖片的中部。電子舌能夠識別樣品中滋味特征的差異，120、130 ℃和140 ℃處理的3 個樣品有相似的滋味，而其他3 個樣品具有3 種不同的滋味。

2.5 YE經不同溫度熱處理后鮮味肽的分離純化結果

圖5 超濾截留組分的鮮味評價Fig.5 Evaluation of umami intensity of ultraf i ltration fractions

根據電子舌分析的結果，本研究只利用鮮味最強的110 ℃處理組。從圖5中可看出，經過超濾得到的不同分子質量的肽鮮味不同，隨著分子質量的減小鮮味增加，不超過1 000 Da組分的鮮味最強。因此使用不超過1 000 Da組分進行下一步實驗。

圖6 110 ℃處理YE后凝膠過濾色譜圖Fig.6 Gel fi ltration chromatogram of YE after treatment at 110 ℃

如圖6所示，根據峰形將樣品分為5 組，其中GEL-2峰豐度最高。將凝膠過濾組分大量分離制備后冷凍干燥，進行感官評價（表2）。其中GEL-2、GEL-3都具有鮮味，得分分別為7.35±0.82和1.32±0.61，選擇GEL-2組分進行下一步分離純化實驗。

GEL-2組分經RP-HPLC分離純化得到4 個峰（圖7）。如表3所示，F(xiàn)1、F3、F4組分具有鮮味，得分分別為7.90±0.36、9.03±0.62、5.83±0.25。收集具有鮮味的肽段進行下一步實驗。

表2 凝膠過濾各組分滋味的感官評價Table2 Taste prof i les of fractions obtained by gel permeation chromatography

圖 7 GEL-3組分的RP-HPLC圖Fig.7 RP-HPLC chromatogram of fraction GEL-3

表3 RP-HPLC各組分的滋味分析Table3 Taste pro fi les of RP-HPLC subfractions

2.6 YE經不同溫度熱處理后鮮味肽的鑒定結果

表4 YE肽RP-HPLC組分中肽序列結構的鑒定及二級離子碎片歸屬Table4 Fragment ions and proposed peptide sequences of selected peptides in RP-HPLC subfractions

研究表明，在多肽的碰撞誘導解離過程中，肽鏈一般在化學能較低的肽鍵處斷裂。由n 個氨基酸脫水縮合而成的多肽，在由N端開始的第m個氨基酸與第（m＋1）個氨基酸之間發(fā)生了斷裂，根據斷裂位點與肽鍵的關系，會產生a-x、b-y和c-z型3 種斷裂方式，其中，肽鏈N端的子離子碎片連續(xù)命名為am、bm、cm離子，C端的子離子碎片連續(xù)命名為xm、ym、zm離子。在Q-TOF-MS/MS中，b-y型斷裂為常見的方式；此外，am-NH3、ym-H2O等也是常見的子離子碎片類型[30]。

將收集得到的RP-HPLC組分依次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測，利用其對目標肽分子進行打碎，結合肽鏈的斷裂規(guī)律，人工解析出4 條具有鮮味的肽段（表4）。典型的MS/MS圖如圖8所示。在110 ℃處理的樣品中鑒定出的鮮味肽段為Gln-Leu、Pro-Glu-Thr、Ala-Pro-Ala和His-Val。

圖 8 110 ℃處理后鮮味肽段的UPLC-Q-TOF-MS/MS圖Fig.8 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis of umami peptides in YE after treatment at 110 ℃

3 結 論

YE是一種天然新型調味品，作為復配料被廣泛應用于食品生產中，在加工食品的調味料中具有廣闊的應用前景。在熱處理過程中，YE中的滋味物質含量和小分子滋味肽結構上有所變化，所產生的呈味化合物也有所不同。然而，對于熱處理對其滋味的影響研究甚少。本研究在不受其他因素干擾的條件下，以單一的熱處理溫度為因素，分析具有鮮味的化合物的變化規(guī)律并鑒定鮮味肽段，找到最適溫度以達到其鮮味增強的效果。結果表明，溫度對熱反應的影響很大，熱處理溫度為110 ℃時鮮味最強。本研究結果為酵母提取物在加工食品中的進一步應用提供了良好的理論依據。本研究只選擇溫度作為影響因素，因此需要進一步研究底物濃度、pH值和反應時間的影響，找到最佳的熱反應條件以提高YE的鮮味。