任明亮，李 輝，劉冬斌，陳國雄，譚鎮(zhèn)南，劉 鵠

(南方醫(yī)科大學附屬南海醫(yī)院骨科，廣東 佛山 528000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)為一種漿細胞系惡性腫瘤，目前尚無完全治愈方法，分析MM的發(fā)病機制可為靶向藥物的研發(fā)提供依據(jù)[1]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼的RNAs，可同靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)互補結(jié)合抑制mRNA翻譯或降解mRNA鏈，因此miRNA可能通過影響mRNA翻譯過程而影響細胞多種功能，近期有研究顯示miR-21、miR-32、miR-19a和miR-92a參與MM發(fā)生發(fā)展[2，3]。而miR-145、miR-145-3p也是miRNA家族成員之一，被認為是腫瘤抑制基因，可靶向調(diào)控多個腫瘤相關(guān)基因，繼而影響腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，已有研究證實miR-145與急性髓系白血病、骨髓間充質(zhì)干細胞成骨發(fā)生密切相關(guān)，但miR-145-3p對MM的調(diào)控機制研究較少[4，5]。本文分析了miR-145-3p在MM中表達情況及其靶向調(diào)控P21/ULK1/LAMP2信號通路對MM細胞的凋亡與自噬作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年6月至2017年5月我院收治的MM患者60例(MM組)、健康體檢者30例(正常組)，納入標準：①MM患者符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2013年修訂)》[6]中相關(guān)診斷標準，經(jīng)組織活檢或骨髓涂片、單克隆抗體免疫球蛋白、X射線檢查確診；②MM患者漿細胞在10%～30%；③均知情同意本研究并簽署知情同意書，且正常組無心、肝、腎等重要臟器疾病。MM組男33例，女27例；年齡20～54歲[(37.15±4.03)歲]，正常組男14例，女16例；年齡21～52歲[(37.12±4.05)歲]，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，有可比性。

1.2方法

1.2.1miRNA提取及細胞株來源 所有入組患者均進行骨髓穿刺，留取新鮮血漿2～4 ml，采集血液樣本均置于血常規(guī)EDTA-K2抗凝管，后采用QIAGEN試劑盒以Trizol法抽提miRNA，并取2 μl在核酸蛋白定量測定儀上測定OD值，進行鑒定與準確定量。MM細胞株U266、RPMI-8266、LP-1、H929(各30株)，均由本院血液科提供，經(jīng)MACS分選CD138+漿細胞作為正常對照組細胞。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄及引物設計與合成 按TaKaRa公司試劑盒COde NO.RR718提供說明書進行，20 μl混合反應液包括：dNTP 2 μl，10X RT Buffer 2 μl，RT特異引物(1 μm)0.3 μl，Total RNA 100 ng，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μl)0.2 μl，RNA酶抑制劑(40 U/μl)0.3 μl，RNase Free dH2O補足至20 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min。

1.2.3熒光定量PCR反應 以熒光定量PCR法(ABI7900實時熒光PCR儀，購自美國Applied Biosystems公司)檢測miR-145-3p水平，反應體系：2×Master Mix 5 μl，cDNA 2 μl，10 uM的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μm的PCR特異引物R 0.5 μl，以RNase Free dH2O補足至10 μl，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染實驗 ①選取毒性最低的人骨髓瘤細胞株LP-1(30株)，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，加10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素0.1 mg/ml)進行常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細胞至最佳狀態(tài)，計數(shù)后調(diào)整濃度，細胞密度為1×105/ml；②吸取2.5 μl miR-145-3P mimic/inhibitors[均由廣州閱博生物技術(shù)公司負責設計合成，其中miR-145-3P mimic為miR-145-3P的模擬物(mimic組)，miR-145-3P inhibitors為miRNA抑制物(inhibitor組)，均為即用型]，同時設立轉(zhuǎn)染對照組[siR-RiboTMTransfection Control(Cy3)，Standard，1 nmol]，三組各10株；③取1 μlRNAimax試劑加入Opti-MEM混合液，輕柔混勻，將稀釋好的試劑在室溫下靜置20 min；④在24孔細胞平板中加入500 μl細胞懸液，混勻，miR-145-3P終濃度為150 nM(miR-145-3P inhibitor為250 nM)；⑤收集細胞，以流式細胞儀(FC500MCL，美國貝克曼庫爾特公司)檢測轉(zhuǎn)染5 d內(nèi)細胞凋亡情況。

1.2.5miR-145-3p基因作用靶點分析 采用生物信息學軟件及網(wǎng)站miRanda、Targetscan等預測miR-145-3p與凋亡、自噬相關(guān)作用的靶點。以westren blot試驗檢測上述轉(zhuǎn)染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平：配制5%濃縮膠(1、2、3、4 ml)、12%分離膠(5、10、15、20 ml)，放置在4 ℃冰箱備用，后取適量蛋白及5×loading buffer按4∶1混合，進行電泳轉(zhuǎn)膜、封閉與抗體反應、顯影、曝光成像。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時點OD值及不同組間P21、ULK1、LAMP2水平比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1MM組及正常組miR-145-3p表達水平比較

MM組血漿及U266、RPMI-8266、LP-1、H929細胞株中miR-145-3p表達水平均低于正常組(P< 0.05)。見表1。

表1 MM組及正常組miR-145-3p表達水平比較

*與正常組比較，P< 0.05

2.2不同轉(zhuǎn)染細胞中OD值比較轉(zhuǎn)染后隨時間延長，三組OD值均增加，且轉(zhuǎn)染后3 d及5 d OD值大小分別為mimic組<對照組

表2 不同轉(zhuǎn)染細胞中OD值比較

*與轉(zhuǎn)染1d比較，P< 0.05；#與對照組比較，P< 0.05；&與inhibitor組比較，P< 0.05

2.3不同轉(zhuǎn)染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平比較轉(zhuǎn)染5 d后，mimic組P21水平高于inhibitor組、對照組，而ULK1、LAMP2水平低于inhibitor組、對照組(P< 0.05)。見表3、圖1。

表3 不同轉(zhuǎn)染細胞中P21、ULK1、LAMP2水平比較

*與對照組比較，P< 0.05；#與inhibitor組比較，P< 0.05

3 討論

MM是起源于骨髓漿細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，患者骨髓中漿細胞克隆性增殖積聚，分泌單克隆免疫球蛋白或其片段，造血干細胞移植為治療MM最有效方法，但受脊髓來源、配型及高醫(yī)療費因素影響，限制了其在臨床的應用，而新型靶向藥物應用為MM提供了新的選擇，明確MM作用機制是研制新型靶向藥物的關(guān)鍵[7]。大量研究證實，表觀遺傳學調(diào)控方式，包括miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾等調(diào)控在MM發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，徐艷妮等[8]的研究發(fā)現(xiàn)miRNA家族中miR-29a、miR-155、miR-16值變化可作為MM的分子生物學診斷標志，其中miR-29a/miR-16值對MM診斷價值最高。而iR-145為近年來新發(fā)現(xiàn)的參與急性髓系白血病等細胞侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、分化、凋亡的miRNA分子[9]，有miR-145-5p、miR-145-3p兩種形式，已有研究證實miR-145-5p在肺鱗狀細胞癌、前列腺癌發(fā)病中起著重要作用，而關(guān)于miR-145-3p在MM中的作用機制尚不明確[10，11]。

圖1 電泳結(jié)果(NC-miR為陰性對照)

本次研究結(jié)果顯示熒光定量MM組血漿及細胞株(U266、RPMI-8266、LP-1、H929)中miR-145-3p水平均較正常組低，證實miR-145-3p在MM患者的血漿及細胞株中均發(fā)生了表達下調(diào)，體內(nèi)體外實驗結(jié)果均表明，在U266、RPMI-8266、LP-1、H929細胞株中低表達miR-145-3p可能促進MM發(fā)生發(fā)展，具有一定的臨床應用潛力。藥物主要通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)caspase蛋白酶家族等途徑而誘導細胞凋亡，在MM藥物治療中，部分患者會出現(xiàn)caspase家族蛋白調(diào)控失控，導致凋亡途徑異常，對地塞米松等藥物耐受，因此分析其凋亡機制十分必要[12]。本次研究則發(fā)現(xiàn)，在分別轉(zhuǎn)染miR-145-3p mimic、inhibitor后，隨時間延長，mimic組、inhibitor組、陰性對照組OD值均增加，且轉(zhuǎn)染后3 d、5 d OD值大小分別為mimic組<對照組

綜上所述，miR-145-3p在MM患者中呈低表達狀態(tài)，可能通過激活P21、抑制ULK1/LAMP2信號通路而促進細胞凋亡、自噬作用。