周麗平，袁 亮，趙秉強(qiáng)，李燕婷，林治安

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

腐殖酸是動(dòng)植物遺骸經(jīng)過微生物的分解和轉(zhuǎn)化以及地球化學(xué)、物理的一系列變化過程而形成積累起來的一類具有多種官能團(tuán)的大分子有機(jī)弱酸混合物。植物木質(zhì)素及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等都是參與該過程的重要組分[1]。因此，腐殖酸對植物生長發(fā)揮著重要作用[2-4]，研究表明，腐殖酸對植物生長發(fā)育的影響受分子量的影響較大。聚合程度低、分子量小的腐殖酸 (＜ 3.5 kDa) 更能提高根系H+-ATP酶的活性，以促進(jìn)作物生長，這可能是因?yàn)樾》肿恿扛乘嵋子诒蛔魑镂?，且含有較高含量的酸性官能團(tuán)[5-6]。也有研究表明，聚合程度高、分子量大的腐殖酸 (＞ 3.5 kDa) 能提高玉米根系H+-ATP酶活性，從而提高質(zhì)子泵活力，此外，大分子量腐殖酸具有較好的殘留效應(yīng)[7-8]。這些研究并未得到一致的結(jié)論。

目前，關(guān)于腐殖酸對玉米植株不同器官的碳水化合物、蛋白質(zhì)和核酸等的相關(guān)研究多采用蒽酮比色法、Somogyi法、考馬斯亮藍(lán)染色法和PCR法等[9-12]，這些方法制樣過程復(fù)雜、樣品用量多、測試時(shí)間長，不利于快速、大量地進(jìn)行植株樣品分析和測定。傅里葉變換紅外光譜 (FTIR) 是一種主要基于化合物中極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，它可通過特征紅外吸收峰以及標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫檢索對樣品中碳水化合物、脂類和核酸等官能團(tuán)進(jìn)行定性和定量分析。該方法具有靈敏度高、制樣方法簡單、樣品用量少、測試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。前人已經(jīng)將該技術(shù)用于作物養(yǎng)分脅迫、作物病蟲害檢測和吸附性能等的檢測[15-18]，但鮮有研究用FTIR方法來檢測腐殖酸處理下作物根、莖和葉各器官中主要代謝物的變化，而此方法若用于植株各器官的化學(xué)組分測定，可為高效篩選腐殖酸材料提供方法，為腐殖酸材料的進(jìn)一步高效利用提供技術(shù)支持。

綜上可知，腐殖酸的分子量大小可影響植物體的生長發(fā)育，但利用FTIR方法研究腐殖酸處理下植物體內(nèi)不同器官的化學(xué)組分變化，尚未見到文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以玉米鄭單958為供試作物，以來源較廣的風(fēng)化煤腐殖酸為試驗(yàn)材料，利用FTIR技術(shù)對玉米植株不同器官的主要代謝物進(jìn)行分析，以研究不同分子量風(fēng)化煤腐殖酸對玉米生長的作用機(jī)理，從而為風(fēng)化煤腐殖酸影響玉米生長與生理代謝的機(jī)理研究提供參考，并為風(fēng)化煤腐殖酸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試夏玉米品種為鄭單958 (Zea mays L.)。供試風(fēng)化煤來自內(nèi)蒙古棋盤井煤礦 (107°12'E、39°21'N，內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市)，腐殖酸 (HA) 是采用IHSS標(biāo)準(zhǔn)方法從風(fēng)化煤中提取[19]，提取率為50.4%。供試腐殖酸的碳、氫、氧和氮含量分別為47.0%、4.89%、1.04%和33.6%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 腐殖酸的分級 將腐殖酸樣品 (HA) 采用超濾法按分子量 ＞ 50 kDa、10～50 kDa 和 ＜ 10 kDa 分為三個(gè)不同的級分，分別編號為HAH、HAM和HAL，基本元素特性如表1。

1.2.2 溶液培養(yǎng)試驗(yàn) 試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所人工氣候室進(jìn)行，白天溫度為28℃，夜間溫度為20℃，光照強(qiáng)度為500 μ m o l/(m2·s)。所用營養(yǎng)液為霍格蘭營養(yǎng)液[Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L、KNO30.51 g/L、MgSO4·7H2O 0.49 g/L、KH2PO40.14 g/L、EDTA-Fe 0.036 g/L、H3BO32.86 mg/L、MnCl2·4H2O 1.81 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、H2MoO4·4H2O 0.09 mg/L][20]。試驗(yàn)設(shè)不添加腐殖酸 (CK)和分別添加分子量 ＞ 50 kDa(HAH)、10～50 kDa(HAM) 和 ＜ 10 kDa(HAL) 腐殖酸碳 10 mg/L 四個(gè)處理。

玉米種子經(jīng)70%的酒精表面消毒10 min，用蒸餾水洗凈后，在蒸餾水中浸泡24 h，轉(zhuǎn)移至石英砂中，在25℃下遮光環(huán)境中萌發(fā)3天，出苗后移入生長室。兩葉一心時(shí)，精選出苗整齊的幼苗，去掉胚乳后移入盆缽中緩苗，每盆一株。緩苗營養(yǎng)液pH為6.0 ± 0.5 (用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH)，2天后換成完全營養(yǎng)液，每隔一天更換一次營養(yǎng)液。試驗(yàn)設(shè)6次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。

表1 供試腐殖酸分子量、元素含量和摩爾比Table 1 Molecular weight, elemental contents and mole ratios of the tested humic acids

表2 添加不同分子量腐殖酸處理對玉米干生物量的影響Table 2 Dry biomass of maize as affected by humic acids with different molecular weight

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 干物質(zhì)重 移苗20 d后，將玉米植株分為根、莖和葉，蒸餾水清洗后，于105℃下殺青30 min，65℃下烘干至恒重，稱重。根冠比為根系干重與地上部干重的比值。

1.3.2 紅外光譜分析 將烘干的玉米植株根、莖和葉磨碎后過0.2 mm篩，分別稱取1 mg樣品與200 mg溴化鉀 (KBr)，放入瑪瑙研缽中研磨均勻后進(jìn)行壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀 (型號VERTEX 70，德國Bruker公司) 檢測玉米植株根、莖和葉的光譜特征 (波數(shù)范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和Origin 9.0軟件進(jìn)行處理和作圖，采用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件Duncan方法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐殖酸處理對玉米干物質(zhì)重的影響

添加腐殖酸可增加玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重，隨著腐殖酸分子量的增加，各器官干物質(zhì)重顯著降低 (表2)。與對照相比，腐殖酸處理的玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重的平均值分別提高了91.07%、89.27%和88.53%。各腐殖酸處理之間比較，HAL處理的玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重最大，與對照相比，分別提高了143.14%、123.41%和150.54%，其次為HAM處理，HAH處理玉米的根、莖和葉的干物質(zhì)重與對照相比，其提高幅度最小。

2.2 玉米根FTIR分析

腐殖酸處理下玉米植株主要基團(tuán)及其FTIR的峰值位置見表3。

腐殖酸處理和對照處理的根系紅外光譜的特征峰位置基本相同，但透射率不同 (圖1)。腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 處理的玉米根系紅外光譜在3420 cm-1和1655 cm-1波數(shù)附近的透射率明顯低于對照，由此可知，添加腐殖酸可有效增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類物質(zhì)的含量，其中，添加低分子量腐殖酸效果最佳。

2.3 玉米莖FTIR分析

由圖2可知，腐殖酸處理和對照處理玉米莖的紅外光譜特征峰對應(yīng)的波數(shù)基本相同。所有腐殖酸處理玉米莖的紅外光譜在3420 cm-1和1655 cm-1波數(shù)附近的透射率均高于對照處理，低分子腐殖酸表現(xiàn)尤為明顯。這表明，腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 處理減少了碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類物質(zhì)在玉米莖部的積累。另外，HAH和HAM處理在1250 cm-1波長附近的透射率要高于對照處理，而HAL處理在1250 cm-1波長附近的透射率低于空白對照，這表明HAH和HAM處理減少了核酸在玉米莖部的積累，HAL處理增加了玉米莖部核酸的含量。

表3 主要功能團(tuán)、來源及其FTIR的峰值Table 3 Resource and wave length of main functional groups

圖1 不同分子量腐殖酸處理玉米根系FTIR光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of maize roots under treatments of humic acids with different molecular weight

2.4 玉米葉FTIR分析

圖2 不同分子量腐殖酸處理玉米莖FTIR光譜圖Fig. 2 FTIR spectra of maize stems under treatments of humic acids with different molecular weight

圖3 不同分子量腐殖酸處理玉米葉FTIR光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of maize leaf under treatments of humic acids with different molecular weight

由圖3可知，所有處理玉米葉的紅外光譜在3420、2920、1735、1655、1518、1380、1250 和1050 cm-1波數(shù)附近均有特征峰，腐殖酸各處理玉米葉的紅外光譜在以上各波長處的透射率均低于對照處理，這說明，腐殖酸處理能夠增加玉米葉片碳水化合物、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類物質(zhì)和核酸等的含量。各腐殖酸處理之間比較，HAL處理在各波長處的透射率均為最低，這說明小分子量腐殖酸處理更容易增加玉米葉片的碳水化合物、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)類物質(zhì)和核酸等的含量。

3 討論與結(jié)論

外源添加腐殖酸可促進(jìn)玉米植株的生長發(fā)育，增加玉米根、莖和葉的干物質(zhì)重。這主要是因?yàn)楦乘岷卸喾N活性官能團(tuán)，使其具有酸性、親水性、界面活性、陽離子交換能力、絡(luò)合作用及吸附分散能力[30-32]，從而促進(jìn)作物根系對養(yǎng)分的吸收利用，并調(diào)控植物生長發(fā)育的原生代謝和次生代謝過程。另外，腐殖酸本身就是一種天然有機(jī)高分子混合物，可為植物的生長發(fā)育提供營養(yǎng)。還有研究表明，腐殖酸能夠發(fā)揮生長素活性，促進(jìn)H＋泵作用，降低細(xì)胞壁的pH值，激活細(xì)胞壁上的pH敏感酶和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞壁疏松，以使植物生長[33]。

不同分子量 (尤其是 ＜ 10 kDa分子量) 腐殖酸能夠增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類物質(zhì)的含量，減少其在莖中的積累，增加玉米葉片碳水化合物、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類物質(zhì)和核酸等的含量，從而促進(jìn)玉米的生長發(fā)育。這可能是因?yàn)?，腐殖?(尤其是小分子量腐殖酸) 可上調(diào)或下調(diào)某些基因，并通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)影響植物的原生代謝過程，以影響不同器官蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等的含量[5,34]。

小分子量 (＜ 10 kDa) 腐殖酸能更好地促進(jìn)玉米的生長發(fā)育。這可能是因?yàn)樾∮?0 kDa分子量腐殖酸因分子量低且含較高含量的羧基和酚羥基，因而具有更好的金屬絡(luò)合能力，從而改善了營養(yǎng)物同化和玉米代謝能力[35]。另外，腐殖酸本身就具有營養(yǎng)功能，＜ 10 kDa分子量腐殖酸更易于進(jìn)入植物體內(nèi)，促進(jìn)植物生長。而大分子量 (＞ 50 kDa) 腐殖酸可能因具有較多穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和成分，有更好的殘留效應(yīng)[36]。Piccolo等的研究表明，只有小分子量腐殖酸表現(xiàn)出了類激素活性，并且分子量越小，類激素活性越大。此外，低分子量腐殖酸具有較高含量的酸性官能團(tuán)，因此可促進(jìn)植物的生長發(fā)育[5]，這一結(jié)論也解釋了本研究結(jié)果，值得進(jìn)一步研究。

總之，利用FTIR技術(shù)可揭示腐殖酸處理下玉米植株中不同器官組分的變化。腐殖酸處理能夠增加玉米根系碳水化合物、蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類物質(zhì)的含量，減少其在莖中的積累，增加玉米葉片碳水化合物、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類物質(zhì)和核酸等的含量，低分子量腐殖酸表現(xiàn)尤為明顯。