劉佳佳，李崴一，倪偉偉，劉 佩，陳慧敏，趙奎成，肖竹平

吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 武陵山地區(qū)民族藥解析與創(chuàng)制湖南省工程實驗室，吉首 416000

我國是花生種植大國，年產(chǎn)量約1 500萬噸，超過世界花生總產(chǎn)量的1/3[1]，花生殼作為花生行業(yè)的一個主要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量近500萬噸，為花生殼的綜合利用提供了豐富的資源。但目前以低附加值的利用為主，如在工業(yè)上作為吸附材料，在農(nóng)業(yè)上用作飼料、食用菌的培養(yǎng)基等等[2]。事實上花生殼中含有多種功能物質(zhì)，如黃酮類化合物、膳食纖維、天然黃色素、甾醇、胡蘿卜素等等。其中黃酮類化合物因具有廣泛的生物活性而引起了科研工作的持續(xù)關(guān)注，包括抗氧化、抗菌、抗炎、增強免疫力、降血脂、改善微循環(huán)等等[3]。Diaige的研究揭示花生殼中黃酮類化合物有木犀草素(1)、圣草酚(2)、5,7-二羥基色原酮(3)等，其中以木犀草素含量最高[4]。黃酮類物質(zhì)的共同結(jié)構(gòu)特征是含有由A、B、C環(huán)組成的三環(huán)骨架，主要區(qū)別是取代基的位置、數(shù)量以及C環(huán)不飽和度的差異，因此黃酮類物質(zhì)表現(xiàn)出許多相似的生理功能。不僅不同植物來源的材料所含黃酮的種類和含量差異很大，而且同一植物來源的材料，產(chǎn)地、采摘季節(jié)、提取方法不同，也會造成黃酮種類和含量的差異。一般來說，提取物中所含的黃酮類化合物彼此間在功能上常存在一定的互補與協(xié)同增效的作用?；谶@種認(rèn)識，許多研究者直接用花生殼的提取物進(jìn)行各種生物活性的研究，探索花生殼潛在的應(yīng)用價值[5,6]。

花生具有一定的預(yù)防和治療胃病的作用，尤其是在飯前，細(xì)嚼慢咽一些花生效果更佳。胃病包括急慢性胃炎、胃潰瘍等。1984年馬歇爾(Barry J.Marshall)和沃倫(Robin Warren)揭示了感染幽門螺旋桿菌(H.pylori)與胃病的直接關(guān)系，從此打破了胃病不能根治的神話[7]，他們也因此獲得了2005年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。幽門螺旋桿菌是一種格蘭氏陰性細(xì)菌，是目前已知的唯一一種可以在胃內(nèi)強酸環(huán)境中長期存活的致病菌，它依靠自身產(chǎn)生的脲酶，將人體體液中的尿素分解為氨和二氧化碳，產(chǎn)生的氨可以中和細(xì)菌表面的胃酸，為細(xì)菌形成了一個接近中性的微環(huán)境[8]。然而分解尿素產(chǎn)生的氨一方面會改變胃粘膜的通透性，造成胃酸對胃壁細(xì)胞的腐蝕，另一方面，氨本身對胃壁細(xì)胞也有腐蝕作用，破壞胃粘膜的完整性，胃酸進(jìn)而加重胃壁細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍的發(fā)展和惡化[9]。對脲酶的抑制有助于根除幽門螺旋桿菌，已發(fā)現(xiàn)多種植物提取物對脲酶有抑制作用，如葡萄提取物、蘋果皮提取物、金銀花提取物、綠茶提取物、蜂蜜提取物等對脲酶具有較好的抑制作用[10-12]?？紤]到花生殼和它們的主要成分一樣，也是黃酮等多酚類物質(zhì)，我們因此對花生殼提取物進(jìn)行了脲酶抑制活性的研究，結(jié)果表明花生殼提取物對脲酶具有良好的抑制作用。

1 實驗材料

1.1 儀器

SpectraMax Plus 384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司，美國)、Nicoya SPR分子作用儀(普瑞麥迪實驗室有限公司，加拿大)、Agilent 1220高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國)、Evolution 201紫外可見分光光度計(賽默飛世爾科技公司，美國)、Heidolph Hei-VAP Value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(海道夫集團，德國)、鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、磁力攪拌器(鄭州紫拓儀器設(shè)備有限公司)、萬能粉碎機(德清拜杰電器有限公司)。

1.2 材料

花生殼(湖南省永州市產(chǎn)花生，帶殼曬干取殼)、脲酶(自提，幽門螺旋桿菌按文獻(xiàn)方法[13]培養(yǎng)和提取脲酶)。

1.3 試劑

硝普鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)；蘆丁(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展公司，HPLC≥98%)；硝酸鋁(成都金山化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)。

2 方法

2.1 花生殼提取物的制備

將花生殼置于干燥箱中，在50 ℃下干燥4 h，用粉碎機粉碎，過20目篩，取60 g花生殼粉于燒瓶中，按料液質(zhì)量體積比1∶20加入70%乙醇，在攪拌下升溫至61 ℃， 在該溫度下提取1.6 h，過濾，提取三次，濾液合并，濃縮至60 mL左右，加入乙醇進(jìn)行醇沉，攪拌1 h，靜置過夜，抽濾，濾液蒸至無乙醇味，干燥。

2.2 花生殼提取物中總黃酮含量的測定

精確稱取蘆丁對照品，用70%乙醇溶液配置成0.2 mg/mL的溶液，分別移取該溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于6個10 mL容量瓶中,用70%乙醇定容，得0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的蘆丁溶液，分別準(zhǔn)確移取某一特定溶液1.44 mL，70%乙醇0.64 mL,5%亞硝酸鈉溶液0.16 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液0.16 mL，混勻，放置6 min，加5%氫氧化鈉溶液1.6 mL，混勻，靜置12 min，在510 nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度，以0.00 mg/mL的溶液為空白對照。以吸光值為橫坐標(biāo)(x)，為蘆丁質(zhì)量濃度縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.144 0x-0.010 9，R2=0.997 6。準(zhǔn)確稱取花生殼提取物0.005 0 g，用 70%的乙醇溶解，并定容至10 mL，用上述相同的顯色方法顯色，并測定吸光度值，按下式計算花生殼提取物中總黃酮的含量。

總黃酮含量(%)=

2.3 花生殼提取物中木犀草素含量的測定

準(zhǔn)確稱取25 mg木犀草素，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，得1 mg/mL木犀草素溶液，再分別配置500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的溶液，然后用HPLC繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以含醋酸1%的水和乙腈為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，在10 min內(nèi)乙腈由10%增至90%，再在3 min內(nèi)由90%降至10%，再恒梯度至結(jié)束，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長345 nm，每個樣品平行測定三次取平均值，以質(zhì)量濃度(y)對峰面積(x×10-7)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=35.1x-4.44，R2=0.999 1，在15.625～250 μg/mL存在良好的線性關(guān)系。準(zhǔn)確稱取0.001 20 g花生殼提取物，用70%的乙醇溶解樣品并定容，配成300 μg/mL的溶液，按上述相同的方法用HPLC進(jìn)行定量， 按下式計算花生提取物中木犀草素的含量。

2.4 花生殼提取物脲酶抑制活性測定

脲酶的活性測試參照文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行[13]，具體步驟如下:第一排設(shè)為空白組，第二排設(shè)為對照組，其余設(shè)為實驗組，在96孔板中每孔加入25 μL脲酶溶液(0.35 μg/mL)，空白組和對照組每孔加入25 μL的磷酸緩沖溶液(50 mM，pH=7.8)，實驗組每孔加入25 μL花生殼提取物的磷酸緩沖溶液，在37 ℃恒溫箱下共培養(yǎng)50 min，空白組每孔加入50 μL的磷酸鹽緩沖溶液，對照組和實驗組每孔加入50 μL的25 mmol/L的尿素溶液。在37 ℃恒溫箱下共培養(yǎng)30 min后，依次加入A試劑50 μL (127 mmol/L苯酚和0.168 mmol/L硝普鈉)和B試劑50 μL(125 mmol/L NaOH和11.3 mmol/L NaOCl)，37 ℃下顯色35 min，在620 nm下測定吸光值A(chǔ)，抑制率按如下公式計算：

2.5 花生殼提取物與脲酶作用的動力學(xué)

用Nicoya SPR分子作用儀對花生殼提取物進(jìn)行配體-酶的動力學(xué)分析。將花生殼提取物用PBS溶液溶解，并配成53.0、26.5、13.3 μg/mL的溶液，裝載已固定好脲酶的功能納米金芯片，流動相為PBS溶液，進(jìn)樣量200 μL，流速20 μL/min，儀器記錄下分析物-酶的結(jié)合-解離動力學(xué)曲線，用TraceDrawer軟件對曲線進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。

2.6 分子對接

幽門螺旋桿菌脲酶的單晶X-衍射結(jié)構(gòu)從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫中下載(PDB 編號：1e9y)[14]，通過SYBYL-X(2.1.1，Tripos,Inc.,St.Louis,MO)軟件[15]處理脲酶-乙酰氧肟酸復(fù)合物分子，移去復(fù)合物分子中的共結(jié)晶水、配體乙酰氧肟酸和重復(fù)結(jié)構(gòu)單元、無活性點的亞基，對處理后的大分子進(jìn)行加氫處理，將乙酰氧肟酸結(jié)合口袋作為活性點用于對接，基于SYBYL-X中的CSCORE模塊對配體對接構(gòu)象進(jìn)行打分，打分函數(shù)包括ChemScore、D-Score、G-Score和PMF-Score等，基于打分函數(shù)選取最佳配體構(gòu)象。

3 結(jié)果與討論

3.1 花生殼提取物的制備

考慮到花生殼提取物在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域中應(yīng)用的可能性，排除氯仿、二氯甲烷、甲醇等作為提取的溶劑，選用安全性高的第三類溶劑乙醇進(jìn)行提取，通過篩選，用70%的乙醇對花生殼進(jìn)行提取可以獲得比較理想的提取效果。60 g花生殼用該溶劑提取三次，得淺棕色膏狀物質(zhì)3.48 g，提取率為5.8%，與文獻(xiàn)報道的提取率接近[16]，提取率按如下公式進(jìn)行計算：

3.2 花生殼提取物的主要組成

用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定提取物中總黃酮含量，以蘆丁作為參比物質(zhì)繪制工作曲線(圖1)，測得花生殼中總黃酮的含量按蘆丁計為29.5%。用同屬于第三類溶劑的乙酸乙酯提取，雖所得提取物中總黃酮含量更高，可達(dá)33.9%，但提取率較低，為1.6%[17]，相比之下，本研究使用70%乙醇可以獲得更高的提取效率，對花生殼總黃酮的提取率可達(dá)1.71%，高于文獻(xiàn)中類似方法的總黃酮提取率(0.25%～1.42%)[18]，但低于酶法總黃酮的提取率(3.08%)。相比之下本研究使用的方法操作簡單、工藝成熟，易于放大生產(chǎn)。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

采用高效液相色譜外標(biāo)定量法測定花生殼提取物中的木犀草素，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，據(jù)此測定出花生殼提取物中木犀草素的含量為11.7%，雖然提取物中總黃酮含量有29.5%，但那是按蘆丁計所得的含量，若轉(zhuǎn)化為按木犀草素計，則應(yīng)該是13.8%，與按高效液相外標(biāo)定量測定的含量十分接近，這與文獻(xiàn)報道的花生殼提取物中總黃酮以木犀草素為主的研究結(jié)果是一致的[18]，花生殼中木犀草素的含量占總黃酮的84.8%。對木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品和花生殼提取物的液相色譜圖(圖3)進(jìn)行比較，進(jìn)一步證明了上述論斷。

圖2 木犀草素含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for determination of luteolin content

圖3 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品和花生殼提取物的液相譜圖Fig.3 Liquid phase spectrum of luteolin standard and peanut shell extract

3.3 花生殼提取物脲酶抑制活性

采用課題組使用多年的脲酶活性測定的方法，測定了花生殼提取物的脲酶抑制活性，提取物對脲酶表現(xiàn)了很好的抑制活性，當(dāng)提取物濃度達(dá)到1.25 mg/mL時幾乎完全抑制了脲酶的活性，抑制率達(dá)到96.6%，將提取物濃度的對數(shù)與脲酶抑制率按Logistic函數(shù)進(jìn)行非線性擬合(圖4)，擬合結(jié)果表明花生殼提取物抑制脲酶的IC50為48.1±2.7 μg/mL，若假定這種抑制的貢獻(xiàn)全來自于木犀草素，則折合后IC50應(yīng)為5.63±0.32 μg/mL(19.69±1.12 μM)，事實上文獻(xiàn)報道的純木犀草素抑制脲酶的IC50應(yīng)為35.4±2.0 μM[19]，花生殼折合活性接近純木犀草素活性的2倍，說明花生殼中的其他成分也對脲酶抑制活性有貢獻(xiàn)，并且存在協(xié)同增效作用?；ㄉ鷼ぬ崛∥锏娘@著脲酶抑制活性為花生殼在預(yù)防和治療胃病方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

3.4 花生殼提取物與脲酶結(jié)合的動力學(xué)

用Nicoya SPR分子作用儀測定了花生殼提取物與脲酶結(jié)合的動力學(xué)過程，獲得如圖5所示分子相互作用動力學(xué)曲線，對動力學(xué)曲線進(jìn)行擬合獲得相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)如下，花生殼提取物與脲酶的結(jié)合-解離平衡常數(shù)KD為0.11±0.02 μg/mL(0.38±0.07 μM)，表明花生殼提取物與脲酶具有很高的親和力。

圖4 花生殼提取物脲酶抑制濃度依賴曲線Fig.4 Urea enzyme inhibition concentration dependence curve of peanut shell extract

圖5 花生殼提取物與脲酶結(jié)合動力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curve of peanut shell extract and urease binding

3.5 分子對接研究

為了說明花生殼中主要活性成分木犀草素使脲酶失活的機制，利用SYBYL軟件將木犀草素與脲酶進(jìn)行對接，對接結(jié)果如圖6所示，木犀草素以B環(huán)的兩個羥基與脲酶活性中心的兩個Ni離子形成較強的配位鍵(1.999-3.781?)，同時這兩個羥基又作為氫鍵供體分別與ASP362和HIS221形成O-H…O(1.990?)和O-H…N(1.594?)，B環(huán)還與ARG338形成N-H…π鍵，鍵長為3.823?，木犀草素的C環(huán)一方面與CYS321形成S-H…π鍵(2.683?)，另一方面與MET366形成C-H…π鍵(2.595?)，這些作用使木犀草素分子與活性口袋形成了緊密結(jié)合，從而使尿素分子無法進(jìn)入活性腔，從而使脲酶失活。

4 結(jié)論

花生殼的乙醇提取物的總黃酮含量以蘆丁計為29.5%，主要黃酮種類為木犀草素，占總黃酮的84.6%，花生殼提取物對脲酶有較好的抑制作用，IC50為48.1±2.7 μg/mL，比純木犀草素具有更低的IC50，揭示了花生殼提取物中的其他成分也有一定的脲酶抑制作用，并與木犀草素存在協(xié)同增效作用。良好的脲酶抑制活性為花生殼提取物用于預(yù)防和治療胃病提供了理論依據(jù)，分子相互作用和對接研究表明木犀草素分子與脲酶具有較強的親和能(KD=0.11±0.02 μg/mL)，通過羥基與Ni離子的配位和木犀草素分子與活性點周圍氨基酸殘基的相互作用，木犀草素分子與脲酶分子產(chǎn)生緊密結(jié)合?；ㄉ鷼ぶ械钠渌迕敢种瞥煞趾椭g的協(xié)同增效作用研究正在進(jìn)行中。

圖6 木犀草素與脲酶活性點結(jié)合模式Fig.6 Luteolin and urease active point binding mode