亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        UFLC-MS/MS研究胡椒堿在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性和代謝表型

        2019-03-08 08:31:08茍立平羅莉婭湯明海
        關(guān)鍵詞:小鼠

        茍立平,鄧 星,羅莉婭,湯明海,萬 麗

        1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137;2四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室,成都 610041

        胡椒堿(Piperine,Pip)為本實驗室從胡椒科植物胡椒(PipernigrumL.)的干燥成熟果實中提取、分離、純化獲得的吡咯烷類酰胺生物堿,純度大于99%。Pip是胡椒發(fā)揮藥效作用的主要成分之一,藥理作用較為廣泛,已知具有抗驚厥[1]、抗炎[2]、抑制膽結(jié)石[3]、抗?jié)僛4]等作用。近年來的研究表明,Pip具有抗癌活性[5-8]。由于其結(jié)構(gòu)簡單(見圖1),有利于對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,且具備藥效基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征,如具有氫鍵接受體、疏水中心和芳環(huán)中心等可與受體結(jié)合的特征性單元。因此,其本身不僅可作為一種新藥進(jìn)行研發(fā),而且化學(xué)研究空間為進(jìn)一步化學(xué)合成研究獲得高活性低毒性先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)[9]。

        圖1 胡椒堿化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Piperine

        體外代謝研究相比之下可直接觀察候選化合物與受試靶點的選擇性作用,不需要消耗大量的樣品和實驗動物,操作簡便快捷,且能指導(dǎo)后期藥效、藥動以及安全性評價的模型選擇,縮小體內(nèi)研究的篩選范圍,節(jié)約研發(fā)成本[10]。為全面了解Pip在不同種屬中的代謝特性,為后續(xù)研究提供支撐,本課題研究了Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性及在人體肝微粒體中的代謝產(chǎn)物,采用選擇性化學(xué)抑制法考察Pip在人肝微粒體中的代謝表型,為深入了解Pip的代謝特征和臨床合理用藥提供依據(jù)。

        1 實驗材料

        超快速液相色譜(UFLC)系統(tǒng)包括:SIL-30AC 自動進(jìn)樣器,LC-30AD 高壓輸液泵,CBM-20A 連接器,CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)、Acquity UPLC?Hss C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);AB SCIEX QTRAP5500三重四級桿質(zhì)譜儀(美國AB公司);數(shù)據(jù)處理軟件(MultiQuant 3.0.2);W201B升降智能水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific公司);230V-U K渦旋混合器(Labnet International公司);BT 125D 電子天平(賽多利斯儀器(北京)有限公司);移液槍(德國 Eppendorf公司)。

        胡椒堿(Piperine,Pip):由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室分離純化而得,純度>99%;內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿對照品,購于成都瑞芬思生物科技有限公司,純度>98%。大鼠、人、犬、猴、小鼠等肝微粒體:20 mg/mL,NADPH發(fā)生系統(tǒng):A液(含MgCl2)、B液,均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,于-80 ℃冷凍保存;α-萘黃酮(α-Naphthoflavone,ANF;純度大于 98.0%,東京化成工業(yè)株式會社);毛果蕓香堿(Pilocarpine,中國食品藥品檢定研究院)、鹽酸噻氯匹定(Ticlopidine,TCP;純度 99.7%,中國食品藥品檢定研究院);奎尼丁(Quinidine,QND;純度>98.0%,TCI 上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司);二乙基二硫代氨基甲酸鈉(Clomethiazole,純度> 99%,sigma 公司)、酮康唑(Ketoconazole,KCZ;純度 99.0%,Dr Ehrenstorfer 公司),磺胺苯吡唑(Sulphaphenazole,SUP;純度>99%,Sigma 公司);水:Milli-Q 18.2 MΩ,25 ℃,由本實驗室制備;甲醇:批號:163629,F(xiàn)isher Scientific 公司;甲酸:色譜純,純度98%,批號:1001003297,F(xiàn)luka Analytical公司。

        2 方法

        2.1 溶液的制備

        Pip溶液的制備:稱取Pip適量,用甲醇溶解為1 mg/mL對照品儲備液。

        內(nèi)標(biāo)溶液的制備:稱取白屈菜紅堿適量,用甲醇稀釋成10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

        2.2 UFLC-MS/MS條件

        液相條件:流速 0.3 mL/min;樣品室溫度:10 ℃;柱溫:30 ℃;流動相為0.1%甲酸水(A相)-甲醇(B相),梯度洗脫,0~2 min,55%~90% B、2~5 min,90%B;進(jìn)樣體積2 μL。

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI)方式,檢測離子為正離子;毛細(xì)管電壓5.5 kV,離子源溫度500 ℃,去簇電壓(DP)為120 V。采用多級反應(yīng)檢測模式(MRM)模式,測定Pip和內(nèi)標(biāo)化合物,其對應(yīng)的監(jiān)測離子對和碰撞能量分別為Pip(m/z286.2→201.1,33 eV),內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿(m/z348.3→332.2,43 eV)。

        2.3 Pip在不同種屬肝微粒體體外代謝孵育模型中的穩(wěn)定性

        2.3.1 代謝穩(wěn)定性孵育模型

        參照文獻(xiàn)[11],每個孵育體系總體積為206 μL,包含188 μL K2HPO4緩沖液(即PBS,100 mM,pH 7.4)和12 μL NADPH發(fā)生系統(tǒng)(10 μL A液和2 μL B液于冰浴上臨時混合制得),冰浴上加入1 μL 200 μmol/L Pip后,于37 ℃預(yù)孵5 min,分別加入5 μL各種屬肝微粒體溶液啟動反應(yīng)。孵育時間為0、5、15、30、45、60 min。待反應(yīng)完畢后,取孵育后的樣品(200 μL)加400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/ mL的冰甲醇終止反應(yīng),渦旋混勻3 min,13 000 rpm離心15 min,取上清液于進(jìn)樣瓶中。平行實驗3次,考察Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性。

        2.3.2 體外半衰期

        將孵育0 min時間點Pip的濃度作為100%,其他孵育時間點的濃度與之相比得剩余百分量,將各時間點的剩余百分量的自然對數(shù)與孵育時間作線性回歸,求算得斜率k,根據(jù)公式半衰期T1/2=-0.693/k;肝微粒體中的固有清除率CLint=0.693×孵育液(mL)/[T1/2(min)×肝微粒體(mg)]。

        2.4 Pip在CYP450酶中的代謝表型研究

        2.4.1 代謝表型研究體系

        根據(jù)文獻(xiàn)[12],代謝表型研究體系采用選擇性化學(xué)抑制劑法。所選的CYP3A4抑制劑為酮康唑(1 μmol/ L),CYP2D6抑制劑為奎尼丁(10 μmol/ L),CYP2C9抑制劑為磺胺苯吡唑(20 μmol/ L),CYP2A6抑制劑為毛果蕓香堿(25 μmol/ L),CYP2C19抑制劑為鹽酸噻氯匹定(50 μmol/ L),CYP2E1抑制劑為二乙基二硫代氨基甲酸鈉(100 μmol/L),CYP1A1為α-萘黃酮(1 μmol/L)。代謝表型反應(yīng)時間、酶蛋白濃度及底物濃度根據(jù)“2.3.1”項下確定。

        設(shè)定Pip孵育濃度為1 μmol/mL,人肝微粒體濃度為20 mg/mL。以2.3.1項下孵育體系,冰浴上加入200 μmol/L的Pip溶液1 μL,各選擇性化學(xué)抑制劑1 μL,在37 ℃預(yù)孵5 min后,加入人肝微粒體溶液5 μL,渦旋混勻,37 ℃孵育10 min,反應(yīng)結(jié)束后,加入400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL的冰甲醇終止反應(yīng),每個樣品平行3份。

        另設(shè)置未發(fā)生反應(yīng)樣品為陰性對照組(不加NADPH發(fā)生液,只加等量甲醇);設(shè)定完全發(fā)生反應(yīng)為陽性對照組(加入NADPH發(fā)生系統(tǒng),但不加抑制劑,只加等量甲醇)。利用UFLC-MS/MS測定Pip的剩余濃度,考察不同選擇性化學(xué)抑制劑對Pip代謝的影響。

        2.4.2 數(shù)據(jù)處理

        抑制率=[1-(陰性對照組濃度-實驗組濃度)/(陰性對照組濃度-陽性對照組濃度)]×100%。利用OriginLab 9.0、EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。

        2.5 體外代謝產(chǎn)物研究

        設(shè)定Pip孵育終濃度為50 μmol/ L,在2.3.1項下孵育體系,冰浴上加入5 000 μmol/L的Pip溶液2 μL,在37 ℃預(yù)孵5 min后,加入人肝微粒體溶液5 μL,渦旋混勻,分別于37 ℃孵育0 min和90 min,反應(yīng)結(jié)束后,加入200 μL冰甲醇終止反應(yīng)。照2.3.1項下處理后,利用UFLC-MS/MS進(jìn)行進(jìn)樣測定。

        2.6 方法學(xué)考察

        2.6.1 專屬性考察

        取PBS 188 μL,加入5 μL高溫滅活的肝微粒體,記為“孵育體系Ⅰ”。取“孵育體系Ⅰ”,加入400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL的甲醇溶液,照“2.3.1”項下的樣品處理方法進(jìn)行處理,即得空白對照樣品A。另取“孵育體系Ⅰ”,加入含內(nèi)標(biāo)10 ng·mL-1的甲醇溶液400 μL和200 μmol/L Pip溶液1 μL,同法處理,得對照樣品B。

        2.6.2 線性關(guān)系

        精密吸取Pip對照品貯備液,用甲醇逐級稀釋為質(zhì)量濃度分別為390.5、781、1 563、3 125、6 250、12 500、25 000、50 000 ng/mL的系列對照品溶液。于“孵育體系Ⅰ”中分別加入1 μL上述系列對照品溶液,渦旋混勻,照“2.3.1”項下樣品處理方法進(jìn)行處理,照“2.2”項下液質(zhì)條件進(jìn)行測定。利用“MultiQuant 3.0.2”數(shù)據(jù)處理軟件,求得直線回歸。

        2.6.3 準(zhǔn)確度

        照“2.6.2”項下,制得質(zhì)量濃度分別為781、31.25、400 ng/mL的低、中、高三組質(zhì)控濃度樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度實驗,同法處理后進(jìn)行分析,計算各質(zhì)控樣品的回收率。每組樣品平行5份。

        2.6.4 精密度

        照“2.6.3”項下,配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品,用質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間RSD表示。日內(nèi)每隔2 h 處理一組低、中、高濃度樣品,共處理5組,計算日內(nèi)精密度。日間精密度連續(xù)3天測定3個分析批次,每個濃度測定5個樣品來計算日間精密度。

        2.6.5 基質(zhì)效應(yīng)

        照“2.6.3”項下,配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品,分別測定峰面積A;另取Pip對照品溶液,加含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL流動相制成相同濃度的溶液,分別測定峰面積B,每組平行5份。基質(zhì)效應(yīng)公式為A / B × 100%,此值應(yīng)在85%~115% 之間。

        3 結(jié)果

        3.1 方法學(xué)考察

        在“2.2”實驗條件下,Pip與內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的保留時間分別為4.27、2.93 min,達(dá)到基線分離,且無空白基質(zhì)干擾,說明該方法專屬性良好,結(jié)果見圖2。利用“MultiQuant 3.0.2”數(shù)據(jù)處理軟件,求得直線回歸為:y=0.131 78x+ 0.378 41(r= 0.995 9),各濃度的準(zhǔn)確度偏差均小于15%,表明在3.91~500 ng/mL范圍內(nèi),Pip的濃度與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系,符合要求。低、中、高質(zhì)控樣品的回收率分別為(110.82 ± 3.91)%、(107.81 ± 4.96)%、(107.96 ± 3.17)%。實驗結(jié)果表明,該濃度范圍內(nèi),回收率較高,準(zhǔn)確度符合要求,測定結(jié)果準(zhǔn)確、可信。日內(nèi)和日間精密度RSD小于5%,符合要求?;|(zhì)效應(yīng)在85%~115% 范圍內(nèi),對測定結(jié)果影響較小。方法學(xué)驗證結(jié)果表明,該方法特異性好,準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)等均符合要求,結(jié)果見表1。

        圖2 Pip及內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Pip and internal standard compound chelerythrine注:A為空白對照樣品;B為加入Pip及內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)對照樣品。Note:A is a blank control sample;B is a standard control sample added Pip and internal standard chelerythrine.

        質(zhì)量濃度Concentration(ng/ mL)準(zhǔn)確度Accuracy精密度RSDPrecision RSD(%)日內(nèi)Day日間Daytime基質(zhì)效應(yīng)Matrix effect(%)低Low110.82±3.913.344.57100.64中Middle107.81±4.964.404.9097.45高High107.96±3.172.083.2898.70

        3.2 Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性

        分別考察了Pip在人、大鼠、小鼠、猴和犬的5個種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性,Pip均發(fā)生了代謝,孵育時間與底物剩余百分比的自然對數(shù)孵育曲線見圖3。其中在猴和犬肝微粒體中代謝較為相似,在小鼠、猴和大鼠肝微粒體中代謝較緩慢,在人和大鼠肝微粒體中代謝較明顯。

        3.3 體外半衰期與固有清除率

        在人、大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中,以孵育時間為橫坐標(biāo),以底物剩余百分比的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)作線性回歸,在肝微粒體中的線性方程人為y=-0.022 1x+4.392(r2=0.935 7),大鼠為y=-0.014 3x+4.375(r2=0.856 8),昆明種小鼠為y=-0.007 4x+4.559 8(r2=0.967 7),恒河猴為y=-0.004 7x+4.601 3(r2=0.991 5),比格犬為y=-0.004 2x+4.592 7(r2=0.991 8)。由各線性的斜率k求得Pip在各種屬中的半衰期和固有清除率(見表2)。

        圖3 Pip在人、大鼠、小鼠、猴和犬5個種屬肝微粒體中各時間點與底物剩余百分比的自然對數(shù)孵育曲線Fig.3 The natural logarithmic incubation curves of Piperine with the percentage of substrate remaining at each time point in human,rat,mouse,monkey and dog liver microsomes

        表2 Pip在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬5個種屬肝微粒體中的體外代謝半衰期和固有清除率

        Table 2 Half-life in vitro and intrinsic clearance of Piperine in human ,rat,mouse,monkey and dog liver microsomes

        種屬 SpeciesT1/2(min)CLintmL/(min·mg)人 Human31.360.0442大鼠 Rat48.460.0286小鼠 Mouse138.60.0100猴 Monkey147.450.0094犬 Dog165.000.0084

        3.4 Pip在人肝微粒體中的代謝表型

        CYP3A4和CYP2C9是參與Pip代謝的主要同工酶,代謝抑制率分別為81.13% 和69.21%。各抑制劑對人肝微粒體中Pip代謝的影響結(jié)果見表3。

        3.5 體外代謝產(chǎn)物研究

        圖4 A為孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對比圖。將孵育0 min的提取色譜圖上保留時間為9.92 min的色譜峰命名為M0。通過圖4 A可知,孵育90 min的提取色譜在M0的基礎(chǔ)上,新增了3個色譜峰,保留時間分別為6.94、7.55、10.21 min,依次命名為M1(6.94 min)、M2(7.55 min))、M3(10.21 min)。[M+H]+峰m/z依次為274.15、318.24和284.19,分別見圖4 D、E、F。各譜圖詳見圖4。

        表3 各抑制劑對人肝微粒體中Pip代謝的影響

        4 結(jié)論

        本文建立了Pip的UFLC-MS/MS定量測定方法,該方法專屬性強(qiáng),靈敏度高,線性、準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)等均符合生物樣品的測定要求。Pip在人、大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中體外代謝半衰期T1/2分別為31.36、48.46、138.60、147.45、165.00 min;體外固有清除率分別為0.044 2、0.028 6、0.010 0、0.009 4、0.008 4 mL·min-1·mg-1,推測Pip在人和大鼠肝微粒體中代謝較接近,代謝相對較快;在小鼠、猴和犬肝微粒體中代謝速率接近,均較慢;表明Pip在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中代謝速率存在明顯的種屬差異。在后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)實驗動物的選擇時,可以考慮采用與人代謝較為接近的大鼠作為參考。目前,CYP代謝酶表型的確定主要有特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑(特異性化學(xué)抑制劑法)和重組人源CYP同工酶法。由于重組人源CYP同工酶法相對來說成本更高,因此本實驗采用選擇性化學(xué)抑制劑法??疾焓茉囁幬锏拇x被作用藥物抑制時,選擇了該酶已知的強(qiáng)抑制劑。代謝表型實驗結(jié)果表明人肝微粒體中參與Pip代謝的酶主要有CYP3A4和CYP2C9。代謝表型的研究可以預(yù)測其潛在的藥物-藥物相互作用。Pip在與其他藥物聯(lián)用時,需考慮經(jīng)CYP3A4和CYP2C9代謝的藥物之間的相互作用,如與經(jīng)CYP3A4代謝的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(如紅霉素、克拉霉素等)、CYP450酶抑制劑咪唑類抗真菌藥(如主要的CYP3A4抑制劑酮康唑、伊曲康唑等)、經(jīng)CYP2C9代謝的藥物(如苯妥英、甲苯磺丁脲)、鈣拮抗劑(如尼卡地平、維拉帕米、美貝拉地爾等)[13,14],實施個體化治療,提高藥物療效、降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。

        圖4 孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對比圖及各色譜峰質(zhì)譜圖Fig.4 The chromatograms of samples incubated for 0 min and 90 min and mass spectrum of each chromatogram peaks注:A為孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對比圖;B為孵育0 min M0質(zhì)譜圖;C為孵育90 min M0質(zhì)譜圖;D為孵育90 min M1質(zhì)譜圖;E為孵育90 min M2質(zhì)譜圖;F孵育90 min M3質(zhì)譜圖。Note:A is Chromatograms of samples incubated for 0 min and 90 min.;B is incubation of M0 spectra for 0 min;C is incubation of M0 spectra for 90 min;D is incubation of M1 spectra for 90 min;E is incubation of M2 spectra for 90 min;F is incubation of M3 spectra for 90 min.

        猜你喜歡
        小鼠
        晚安,大大鼠!
        萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
        視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生令小鼠復(fù)明
        科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        今天不去幼兒園
        清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用
        中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
        米小鼠和它的伙伴們
        高氟對C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達(dá)的影響
        Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
        深夜放纵内射少妇| 国产毛片一区二区日韩| 久久久精品少妇—二区| 亚洲熟妇av一区二区三区| 特级做a爰片毛片免费看无码| 国产午夜福利精品| 中文字幕精品亚洲一区二区三区| av网站在线观看大全| 国产xxxxx在线观看| 国产做无码视频在线观看| 一本一道av无码中文字幕| 亚洲欧美日韩高清中文在线| 日本高清人妻一区二区| 亚洲精品无码精品mv在线观看| 日韩人妻无码一区二区三区| 免费高清日本中文| 国产91久久精品成人看网站| 成人国产一区二区三区| 丰满岳乱妇久久久| 中文字幕有码在线视频| 亚洲黑寡妇黄色一级片| 国产免费av手机在线观看片| 国内精品人妻无码久久久影院导航| 无码久久流水呻吟| 国产一区二区美女主播| 久久久久久av无码免费网站下载| 国产真人无码作爱视频免费| 中文字幕av无码一区二区三区电影| 亚洲女同系列在线观看| 国精品人妻无码一区免费视频电影| 久久艹影院| 免费在线av一区二区| 东北女人啪啪对白| 亚洲欧美另类激情综合区| 午夜无码熟熟妇丰满人妻| 与最丰满美女老师爱爱视频| 色婷婷亚洲精品综合影院| 小12箩利洗澡无码视频网站| 日本一道本加勒比东京热| 国产美女精品视频线免费播放软件 | 8ⅹ8x擦拨擦拨成人免费视频 |