劉延美，汪 靜，李 月，趙家元，袁雪敏，祝靜莉，王 靜*

1鎮(zhèn)江市口腔醫(yī)院，鎮(zhèn)江 212002； 2蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000

舌鱗癌的發(fā)病率一直位居口腔頜面部癌之首。傳統(tǒng)手術(shù)及放化療等治療舌癌帶來的致殘性和全身毒副反應(yīng)等尚不能達(dá)到理想的治療效果。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從吳茱萸果實(shí)中提取的一種重要的生物堿成分，已知具有血管舒張、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗腫瘤等藥理作用。據(jù)報(bào)道它是通過抗增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡對癌癥產(chǎn)生抑制作用[1-3]。盡管學(xué)者們對Evo的抗癌活性做了一些研究，但其作用機(jī)制到目前仍不完全清楚。

中西醫(yī)結(jié)合法不僅能夠增強(qiáng)抗癌療效、減少毒副反應(yīng)、延長生存期、提高生存質(zhì)量、減少手術(shù)并發(fā)癥，而且能提高機(jī)體的免疫力。Du等[4]研究結(jié)果顯示，與小檗堿或Evo單獨(dú)處理相比，小檗堿和Evo聯(lián)合處理以時(shí)間依賴性方式協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞處于G0 / G1期，表現(xiàn)為CDK抑制、p21和p27的表達(dá)水平增加，同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期關(guān)卡蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E、CDK4和CDK6的表達(dá)水平的降低。我們課題組前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究也已證實(shí)Evo聯(lián)合放射線治療能夠增強(qiáng)胃癌SGC7901細(xì)胞的放射敏感性，抑制舌鱗癌Tca-8113 細(xì)胞及裸鼠移植瘤的生長[5-7]。為進(jìn)一步了解Evo聯(lián)合治療的作用療效，本研究首次將中藥Evo聯(lián)合西藥吉西他濱(Gemcitabine，Gem)對舌鱗癌荷瘤裸鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察聯(lián)合治療對裸鼠移植瘤的抑制作用，了解其毒副反應(yīng)，并對誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討，從而為Evo聯(lián)合化療藥物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為舌鱗癌的防治提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 腫瘤細(xì)胞

Cal-27舌鱗癌細(xì)胞由我實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10% 的胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、含5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞單層貼壁生長鋪滿瓶底70%～80% 時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/C nu/nu裸小鼠，雄性，4～5周齡，18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司(合格證書號：SCXK(京)2012-0001)，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級中心實(shí)驗(yàn)室，所用籠具、墊料、飼料、飲用水均經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌處理。

1.3 藥物及試劑

吳茱萸堿(中國食品藥品檢定研究院，中國；質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)使用前溶于蒸餾水中，吉西他濱(ELI LILLY公司，法國)使用前溶于0.9%氯化鈉注射液中；高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(GiBco公司，美國)；二甲基亞砜(Sigma公司，美國)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，中國)；Anti-P65抗體(Sigma公司，美國)；Anti-Ik-βα抗體(Abbkine公司，美國)；Anti-Bcl-2，Anti-Bcl-xl，Anti-Bax及Anti-β-actin 抗體(Immuno Way公司，美國)；兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 舌鱗癌荷瘤裸鼠模型建立

胰蛋白酶消化對數(shù)生長期Cal-27細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min后將細(xì)胞重懸于不含血清的DMEM培養(yǎng)基中。0.2 mL/只注射于裸小鼠左腋側(cè)皮下，每只裸鼠注射2×106個細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)

移植瘤直徑長至約5 mm時(shí),將裸鼠按體重大小隨機(jī)分為模型對照組(Control)、吳茱萸堿組(Evo)、吉西他濱組(Gem)和聯(lián)合組(Evo+Gem)，模型對照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水，吳茱萸堿組灌胃給予Evo(10 mg/kg/0.2 mL),吉西他濱組腹腔注射Gem(50 mg/kg/0.2 mL)，聯(lián)合組為灌胃給予Evo(10 mg/kg)和Gem(50 mg/kg)各0.2 mL，每3天一次，前后共用藥10次，末次用藥3天后頸椎脫臼法處死裸鼠。

2.3 生活指標(biāo)觀察

從分組當(dāng)天開始，每3天測量一次裸鼠的進(jìn)食量及進(jìn)水量，每7天測量一次裸鼠對外界刺激反應(yīng)頻率并繪制折線圖。

2.4 HE染色觀察腫瘤及各臟器組織形態(tài)

瘤體用10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片,二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，伊紅染色，脫水，透明，封片，中性樹脂封固，鏡下觀察。

2.5 透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

腫瘤組織樣品用2.5%戊二醛預(yù)固定，1/15M PBS液漂洗3次，10～15 min/次，1%四氧化鋨后固定1.5 h，1/15M PBS液漂洗3次，10～15 min/次，乙醇梯度脫水，10～15 min /次，100%純丙酮2次，20 min /次，包埋劑(1:1丙酮:EPON-812樹脂(Shell Chemicals,Houston,TX))浸透1 h，包埋，35 ℃/24 h、45 ℃/24 h、68 ℃/24 h聚合，置LKB超薄切片機(jī)上作超薄切片，厚約50～70 nm，切片置于覆有200目的銅網(wǎng)上，枸櫞酸鉛、醋酸柚雙染，透射電鏡下觀察。

2.6 免疫組織化學(xué)染色觀察移植瘤組織中P65、Ik-βα、Bcl-2、Bax的表達(dá)。

石蠟切片烤片，脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水，修復(fù)液修復(fù)，依次加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，封閉用正常山羊血清工作液，一抗(P65、Ik-βα、Bax、Bcl-2)室溫下孵育過夜。滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，室溫孵育15 min。DAB顯色，脫水，透明，封片，中性樹脂封固，鏡下觀察。

2.7 Western blot分析Ik-βα及 Bax的蛋白表達(dá)

提取移植瘤組織蛋白，加SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)變性，微量分光光度計(jì)測定蛋白含量，調(diào)整每個樣品蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制分離膠、積層膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，一抗(Anti- Ik-βα：1∶1 000； Anti- Bax：1∶1 000)孵育過夜，洗膜，二抗孵育，暗盒內(nèi)曝光分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱顯著抑制了裸鼠皮下移植瘤的生長

末次用藥后3天處死動物獲取腫瘤組織觀察，干預(yù)組瘤體體積明顯小于模型對照組，聯(lián)合組體積最小。

圖1 裸鼠移植瘤代表性圖像及瘤體積Fig.1 Representative images and tumor volumes of transplanted nude mice 注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.2 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對舌鱗癌荷瘤裸鼠生活質(zhì)量的影響

給藥期間，各組裸鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量、對外界刺激反應(yīng)頻率均有下降趨勢，與模型對照組相比，藥物干預(yù)組下降緩慢(P<0.05)，聯(lián)合組下降最慢(P<0.01)，提示聯(lián)合治療提高了荷瘤鼠的生活質(zhì)量。

圖2 裸鼠進(jìn)食、進(jìn)水量及應(yīng)激反應(yīng)變化曲線圖 Fig.2 Curve of feeding,water intake and stress response of nude mice 注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.3 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對舌鱗癌荷瘤裸鼠生物毒性影響

由圖3可知，各組裸小鼠的心肌組織纖維排列致密,結(jié)構(gòu)清晰，未見異常；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，未見明顯病理改變；肺組織支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)清晰，支氣管上皮完整，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)，肺泡壁完整，肺泡間隔無充血水腫，肺泡腔無擴(kuò)大，且未見明顯滲出；脾臟組織的紅髓、白髓及邊緣界清晰，形態(tài)均未見異常；腎組織的腎小球、腎間質(zhì)血管及腎小管上皮細(xì)胞正常，未見明顯病理改變。

圖3 HE染色觀察臟器組織形態(tài)(×400)Fig.3 HE staining to observe the organ morphology (×400)

圖4 移植瘤組織石蠟病理光學(xué)顯微鏡切片(×400) Fig.4 Paraffin pathological light microscopy (×400) of transplanted tumor tissue

3.4 腫瘤組織HE染色觀察

模型對照組癌細(xì)胞豐富，生長旺盛，呈彌漫性生長，腫瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，異型性明顯，分化差，核漿比例大，染色較深，形態(tài)不規(guī)則，病理性核分裂像多見；Evo組腫瘤細(xì)胞排列較規(guī)則，數(shù)目減少、體積減小，異型性小，核固縮，核分裂像少；Gem組腫瘤細(xì)胞體積減小，異型性小，分化好，核固縮，核分裂像少；聯(lián)合組中腫瘤細(xì)胞體積減小，異型性較小，分化較好，核固縮，核分裂像少見(圖4)。

3.5 免疫組織化學(xué)檢測分析結(jié)果

光學(xué)顯微鏡下觀察，Bax蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)呈棕黃色顆粒，與模型組相比，Evo組、Gem組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，聯(lián)合組Bax上調(diào)最明顯(P<0.01)。Bcl-2蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)呈棕黃色顆粒，Evo組、Gem組表達(dá)量明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)，聯(lián)合組Bcl-2下調(diào)最明顯(P<0.01)。P65蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)或(和)胞核呈棕黃色顆粒，Evo組、聯(lián)合組表達(dá)量明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P<0.05)。Ik-βα蛋白陽性表達(dá)為胞漿呈棕黃色顆粒，Evo組、聯(lián)合組表達(dá)量明顯增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件對蛋白陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析(圖5)。

圖5 免疫組織化學(xué)分析移植瘤組織中Bax、Bcl-2、P65和Ik-βα的蛋白表達(dá) Fig.5 Immunohistochemical analysis of protein expression of Bax,Bcl-2,P65 and Ik-βα in transplanted tumor tissues注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

3.6 透射電鏡下腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下觀察模型組腫瘤細(xì)胞核體積較大，表面可見微絨毛，胞膜完整，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)均勻，胞質(zhì)內(nèi)可見大量線粒體、游離核糖體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器；Evo組、Gem組細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)邊集，呈現(xiàn)高密度影像，微絨毛數(shù)量減少或消失，呈現(xiàn)早期凋亡特征；聯(lián)合組核內(nèi)異染色質(zhì)碎裂，邊集，濃縮成團(tuán)塊狀，分部在核膜內(nèi)側(cè)，胞膜不完整，核固縮、碎裂，呈現(xiàn)晚期凋亡特征(圖6)。

圖6 透射電鏡觀察裸鼠皮下移植瘤腫瘤細(xì)胞形態(tài)(×6000)Fig.6 Transmission electron microscope observation of tumor cell morphology in nude mice subcutaneous xenografts (×6 000)

3.7 Western blot檢測移植瘤組織中 Bax、Ik-βα蛋白表達(dá)

如圖7所示，與模型對照組相比，Evo組和Gem組均能上調(diào)Bax(P<0.05)的表達(dá)，與單藥組相比，聯(lián)合組上調(diào)更為明顯(P<0.01)，與模型組相比，Evo組和聯(lián)合組明顯上調(diào)了Ik-βα(P<0.05)的表達(dá)。

圖7 吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱對移植瘤組織中Bax、Ik-βα蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Evodiamine combined with Gemcitabine on expression of Bax and Ik-βα protein in transplanted tumor tissues注：與模型對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。Note:compared with the model control group, *P<0.05;**P<0.01.

4 結(jié)論

近年來從天然植物中尋找抗癌成分成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。Hu等[8]研究結(jié)果顯示Evo能使BGC-823細(xì)胞對放射治療敏感并顯著抑制異種移植瘤的生長。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)Evo可能通過mTOR/S6K1介導(dǎo)的Mcl-1下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們課題組前期的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示Evo聯(lián)合Gem能顯著抑制Cal-27舌鱗癌細(xì)胞的增殖?；诖耍狙芯渴状螌vo與Gem聯(lián)合對Cal-27舌鱗癌裸鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物對皮下移植瘤的生長均具有抑制作用(P<0.05)，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)作用更為顯著(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)期間，聯(lián)合組裸鼠進(jìn)食量、進(jìn)水量較模型組(P<0.01)及單藥組(P<0.05)下降緩慢。實(shí)驗(yàn)期間，裸鼠對外界刺激反應(yīng)頻率逐漸減弱，聯(lián)合組減弱速度最為緩慢(P<0.01)。HE染色觀察聯(lián)合組相比較單藥組病理性核分裂像少見，證實(shí)兩藥聯(lián)合具有協(xié)同抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，4個組中無動物死亡，HE染色結(jié)果顯示四組中五臟器形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見病理改變。以上結(jié)果提示吳茱萸堿及吉西他濱均具有抗舌鱗狀細(xì)胞癌的作用，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑制作用更明顯，且無明顯毒副作用，用藥方法及劑量均在安全范圍內(nèi)。

Bcl-2、Bax 是Bcl-2家族中較為經(jīng)典的抗凋亡及促凋亡蛋白，兩者表達(dá)的增高和降低很大程度上反應(yīng)了腫瘤細(xì)胞的凋亡水平。P65是NF-κB信號通路中最為典型的成員之一，而Ik-βα則是Ik-β中最典型的成員，也是NF-κB活化過程中最強(qiáng)的負(fù)反饋因子，它能與P65結(jié)合防止其入核，從而導(dǎo)致NF-κB活化過程的迅速開啟和關(guān)閉。為了進(jìn)一步探討Evo、Gem聯(lián)合作用的機(jī)制，我們檢測了移植瘤組織中Bcl-2、Bax、P65，Ik-βα的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Evo組及聯(lián)合組的P65蛋白表達(dá)下調(diào)，Ik-βα表達(dá)上調(diào)。藥物干預(yù)組相比較模型對照組Bcl-2下調(diào)，Bax上調(diào)，聯(lián)合組最為顯著(P<0.01)。提示吳茱萸堿聯(lián)合吉西他濱抑制舌鱗狀細(xì)胞癌的生長可能與下調(diào)NF-κB/p65、Bcl-2，以及上調(diào)Ik-βα、Bax等蛋白表達(dá)相關(guān)。

中藥聯(lián)合化療因具有增強(qiáng)療效、減少毒副反應(yīng)等優(yōu)勢備受大家的關(guān)注和重視。雖然吳茱萸堿的抗腫瘤作用已被多位學(xué)者證實(shí)，但其抗腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制較為復(fù)雜，通常涉及多個信號通路。Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)WWOX在HepG2和Hepa1-6細(xì)胞中的敲除減弱了Evo對癌細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)，表明Evo通過WWOX依賴性途徑誘導(dǎo)了抗癌活性。Evo可以通過誘導(dǎo)Akt介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肝細(xì)胞癌(HCC)作用[11]，或是通過抑制β-連環(huán)蛋白而對HCC產(chǎn)生抗腫瘤作用[12]。Lin等[13]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Evo顯著降低A549細(xì)胞中AKT /核因子-κB(NF-κB)和Sonic hedgehog / GLI家族鋅指1(SHH / GLI1)信號通路的活性。Sui等[14]研究首次提出Evo可以通過阻斷人類結(jié)腸直腸癌中的p-NF-κB信號通路來減弱多藥耐藥性。Zhao等[15]研究結(jié)果表明，Evo通過下調(diào)PGI以抑制HCT-116人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的遷移，通過失活JAK2 / STAT3途徑來調(diào)節(jié)p53信號傳導(dǎo)途徑的活性以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)MMP3表達(dá)。Liu等[16]等研究結(jié)果表明Evo在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣/ JNK信號介導(dǎo)的自噬和鈣/線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Yang等[17]研究結(jié)果示：Evo通過誘導(dǎo)SHP-1阻斷STAT3信號通路并在體外和體內(nèi)對肝癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

吳茱萸堿尚未作為抗腫瘤藥物在臨床上應(yīng)用，對其進(jìn)一步的研究尤其是聯(lián)合治療的開發(fā)，抗腫瘤分子機(jī)制的研究仍然任重而道遠(yuǎn)。相信隨著對吳茱萸堿研究的進(jìn)一步深入，其抗腫瘤作用及聯(lián)合作用的機(jī)制將逐漸被闡明，從而有一個更加清楚和全面的了解，為其應(yīng)用開拓一片更廣闊的天地。