廖雪華，歐陽(yáng)佩佩，葉 華，2，王 盼，吳科鋒，2*，李文德

（1.廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524023；2.廣東醫(yī)科大學(xué) 南海海洋醫(yī)藥研究院，廣東 湛江524023；3.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州510000）

蕓香科（Rutaceae）植物黃皮（Clausena lansium）是兩廣地區(qū)極常栽培的水果作物，其果實(shí)飽滿、酸甜適中，是嶺南特有的季節(jié)性佳果[1-2]。但黃皮果季節(jié)時(shí)效強(qiáng)，保鮮周期短，每年因天氣、儲(chǔ)藏或采摘不當(dāng)而廢棄的鮮果數(shù)以千噸計(jì)[3-4]。

果膠是一種以α-1,4糖苷鍵連接半乳糖醛酸組成的高分子多糖，存在于植物的果實(shí)、根、莖和葉等部位[5-6]。因其具有良好的增稠、膠凝化、乳化穩(wěn)定等的特性，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品及化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-11]。此外，果膠還具有良好的生理和藥理活性，如降糖、降脂、抑癌和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用[12-13]。目前全球?qū)z的年需求量以每年10%的速度遞增，且國(guó)內(nèi)食用級(jí)果膠的產(chǎn)能受制于原料問(wèn)題，大部分需要靠進(jìn)口解決[14-15]。黃皮中富含機(jī)酸、果膠、生物堿、黃酮等多種活性成分，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[16-17]。目前，黃皮的深加工產(chǎn)品僅為果干、果脯、果汁及果酒等，但這些產(chǎn)品所需黃皮果為優(yōu)等果才有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，無(wú)形中也占用了黃皮果的優(yōu)質(zhì)資源，不利于增加黃皮果產(chǎn)品附加值[18]。有研究報(bào)道[19]，采用微波輔助酸提取法制備黃皮果果膠，在不考慮果膠純度的情況下，粗果膠的產(chǎn)率僅為3.59%，不利于黃皮果果膠的商業(yè)化開(kāi)發(fā)。

目前工業(yè)化生產(chǎn)果膠的方法主要有酸提取法、離子交換樹(shù)脂法、酶法、微波輔助提取法和超聲輔助提取法等，在制備工藝和果膠質(zhì)量上互有優(yōu)劣[20-22]。為了有效對(duì)黃皮果廢果進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)，前期研究發(fā)現(xiàn)黃皮果干基，其粗果膠含量約為20%～28%，總糖含量＞70%，是制備高品質(zhì)果膠的理想原料，若利用黃皮果廢果生產(chǎn)果膠，將會(huì)極大增加黃皮果產(chǎn)業(yè)的附加值。本研究充分結(jié)合當(dāng)?shù)氐膶?shí)際情況和黃皮果的原料特征，在超聲波預(yù)處理的基礎(chǔ)上，采用傳統(tǒng)酸提取法提取果膠，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)選提取黃皮果膠的最佳工藝參數(shù)，為開(kāi)發(fā)利用黃皮果果膠資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃皮粉末：將購(gòu)自廣東茂名的黃皮，除核，洗凈，蒸餾水中浸泡2 h（脫除小分子糖類和部分色素），瀝干，置于沸水浴中滅酶3 min，置于烘箱中進(jìn)行干燥后，粉碎，過(guò)20 目篩，密封貯藏，備用；D-半乳糖醛酸標(biāo)品（純度≥97%）：美國(guó)Sigma公司；檸檬酸、鹽酸、硫酸、無(wú)水乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HX-200高速中藥粉碎機(jī)：浙江省永康市溪岸五金藥具廠；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DZF-6090真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AUW120D型電子分析天平：日本Shimadau公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；LD-UPW-VF超純水機(jī)：上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司；Epoch酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 黃皮果膠的提取工藝流程

稱取干燥黃皮粉末5.0 g，放入500 mL 燒杯中，加入一定量的蒸餾水，攪拌，用鹽酸溶液將pH調(diào)至2.0，在超聲波功率250 W、超聲頻率40 kHz的條件下預(yù)處理30 min，采用熱回流方式進(jìn)行提取，熱抽濾，收集濾液，冷卻至室溫后，加入0.5%提取液質(zhì)量的活性炭，80 ℃脫色20 min，過(guò)濾。濾液蒸發(fā)濃縮至原體積的50%，靜置冷卻，在不斷攪拌下加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇。將果膠醇沉溶液置于25 ℃中靜置90 min，離心分離，收集沉淀，依次用無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為90%、80%、70%、60%的乙醇溶液洗滌，離心收集沉淀，冷凍干燥，即得黃皮果膠。

1.3.2 果膠含量的測(cè)定

采用咔唑-硫酸法測(cè)定果膠含量。半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6支離心管，分別加入質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，并分別加蒸餾水稀釋到50 μL，于冰水浴中沿壁緩緩加入300 μL濃硫酸，混勻后沸水浴中加熱25 min，迅速冷卻至室溫，再分別向離心管中加入10 μL 0.15%咔唑-乙醇溶液，混勻，放置120 min后，在波長(zhǎng)530 nm條件下，測(cè)定其吸光度值，以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.002 9x+0.059 9（R2為0.995）計(jì)算樣品中半乳糖醛酸含量，其計(jì)算公式如下：

式中：X1為果膠樣品中半乳糖醛酸含量，%；C為按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算半乳糖醛酸質(zhì)量濃度，μg/mL；D為稀釋因數(shù)；W為樣品質(zhì)量，mg。

純果膠含量計(jì)算公式如下：

式中：X2為黃皮果中純果膠含量，g；X1為果膠樣品中的半乳糖醛酸含量，%；W1為冷凍干燥后粗果膠的質(zhì)量，g。純果膠得率計(jì)算公式如下：

式中：p為純果膠得率，%；X2為黃皮果中的純果膠含量，g；W2為樣品黃皮的質(zhì)量，g。粗果膠得率計(jì)算公式如下：

式中：X3為粗果膠得率，%；W1為冷凍干燥后粗果膠的質(zhì)量，g；W2為樣品黃皮的質(zhì)量，g。

1.3.3 果膠膠凝度的測(cè)定[23-24]

準(zhǔn)確稱取3.00 g果膠置于250 mL燒杯中，加31 mL蒸餾水，攪拌溶解果膠，加入35.7 g白砂糖使之溶化，濃縮至總質(zhì)量54.7 g。燒杯中加入12.5%檸檬酸溶液1 mL，然后倒入上述果膠糖液，用玻棒迅速攪拌均勻后罩上一只稍大燒杯，室溫靜置24 h，取出果凍，調(diào)向裝入另一燒杯中（注意勿使果凍破裂），采用破碎壓力計(jì)算法測(cè)定黃皮果膠的膠凝度，其計(jì)算公式如下：

式中：G為果膠膠凝度，g/cm2；S為制作果凍時(shí)所用的白砂糖

量，g；m為制作果凍時(shí)所用的果膠量，g；A為滴定水量，g。

1.3.4 提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別在不同的提取溶劑（0.01 mol/L鹽酸、0.05 mol/L硫酸、0.135 mol/L檸檬酸），液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g）），提取溫度（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃），提取時(shí)間（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min），初始pH值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）條件下提取黃皮果膠，提取液經(jīng)過(guò)濃縮、沉淀、離心、干燥后稱取粗果膠質(zhì)量，測(cè)其半乳糖醛酸含量，考察不同的單因素對(duì)純果膠得率的影響。

1.3.5 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃皮純果膠得率為考察指標(biāo)，選取提取溫度（A）、初始pH值（B）、提取時(shí)間（C）、料液比（D）進(jìn)行4因素3水平L（934）正交試驗(yàn)，其因素與水平見(jiàn)表1。

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extractio n technology optimization

1.3.6 黃皮果膠品質(zhì)分析

水分含量：參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》[25]中的直接干燥法；總半乳糖醛酸、酰胺化度、酸不溶灰分參照國(guó)標(biāo)GB 25533—2010《食品添加劑果膠》[26]；二氧化硫：參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.34—2016《食品中二氧化硫的測(cè)定》[27]滴定法；鉛：參照國(guó)標(biāo)GB 5009.12—2017《食品中鉛的測(cè)定》石墨爐原子吸收光譜法[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)純果膠得率的影響

本試驗(yàn)選用了0.01 mol/L鹽酸、0.05 mol/L硫酸和0.135 mol/L檸檬酸作為提取劑[29-30]，考察其對(duì)黃皮純果膠得率及膠凝度的影響，結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不同提取劑對(duì)純果膠得率和粗果膠得率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents on the yield of pure pectin and crude pectin

圖2 不同提取劑對(duì)果膠膠凝度的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the gelatinization of pectin

由圖1可知，不同的提取劑對(duì)純果膠得率有一定的影響，檸檬酸提取黃皮果膠，其粗果膠得率最高為7.82%，但以半乳糖醛酸含量計(jì)，純果膠得率僅為2.89%；而鹽酸提取黃皮果膠，盡管其粗果膠得率最低僅為6.52%，純果膠的得率最高為4.96%。由圖2可知，檸檬酸提取的果膠膠凝度最低僅為81.12 g/cm2，而鹽酸提取的果膠膠凝度最高，達(dá)128.03 g/cm2。因此，綜合考慮，選擇0.01 mol/L鹽酸作為最適黃皮純果膠提取劑。

2.1.2 液料比對(duì)純果膠得率的影響

圖3 不同液料比對(duì)純果膠得率的影響Fig. 3 Effect of different liquid and material ratio on extraction yield of pure pectin

由圖3可知，當(dāng)液料比為10∶1～20∶1（mL∶g）時(shí)，黃皮純果膠得率隨之增加；當(dāng)液料比為20∶1（mL∶g）時(shí)，黃皮純果膠提取效率達(dá)到峰值，得率為5.56%；繼續(xù)增大液料比，純果膠得率有所降低，但變化趨勢(shì)不明顯，后趨于平穩(wěn)。原因是當(dāng)提取效率達(dá)到峰值后，繼續(xù)增大提取液用量，可降低溶液中的果膠濃度，使得醇沉?xí)r無(wú)法充分析出，也會(huì)增加過(guò)濾和濃縮時(shí)間，反而使純果膠的得率下降。因此，液料比選擇20∶1（mL∶g）為宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)純果膠得率的影響

圖4 不同提取溫度對(duì)純果膠得率的影響Fig. 4 Effect of different extraction temperatures on extraction yield of pure pectin

由圖4可知，隨著提取溫度在60～90 ℃范圍內(nèi)的升高，黃皮果純果膠的得率呈明顯上升趨勢(shì)，在提取溫度達(dá)到100 ℃后，純果膠得率最高為6.44%，而90 ℃時(shí)的純果膠得率為6.29%，兩者相比差異不明顯。因此，提取溫度選擇90 ℃為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)純果膠得率的影響

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)純果膠得率的影響Fig. 5 Effect of different extraction time on extraction yield of pure pectin

由圖5可知，提取時(shí)間在60～150 min內(nèi)，黃皮純果膠得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)緩緩增加，但增幅不大；在提取時(shí)間150 min時(shí)，純果膠得率達(dá)到最大為5.29%，而180 min后，純果膠得率有所下降?？赡苁且蛱崛r(shí)間的延長(zhǎng)，果膠在熱水和酸的作用下，發(fā)生水解所致。因此，提取時(shí)間選擇150 min為宜。

2.1.5 初始pH值對(duì)純果膠得率的影響

圖7 不同初始pH值對(duì)純果膠得率的影響Fig. 7 Effects of different initial pH values on extraction yield of pure pectin

由圖6可知，初始pH值為1.0～2.0時(shí)，純果膠得率隨之增加，并在初始pH值為2.0時(shí)達(dá)到峰值，為5.05%，其后隨著初始pH值的增高而逐漸下降，這說(shuō)明選擇合適的H+濃度是提高純果膠得率的關(guān)鍵因素。初始pH值過(guò)低可使果膠分子內(nèi)的甙鍵和酯鍵發(fā)生斷裂，水解成小分子；而在酸性條件下，初始pH過(guò)高則易使果膠轉(zhuǎn)化為果膠酸，溶解性增加，使收率降低密切相關(guān)。因此，選擇初始pH 2.0為宜。

2.2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃皮純果膠得率為考察指標(biāo)，選取提取溫度（A）、初始pH值（B）、提取時(shí)間（C）、料液比（D）進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization

由表2可知，各因素影響純果膠得率的主要順序?yàn)樘崛囟龋ˋ）＞液料比（D）＞初始pH（B）＞提取時(shí)間（C）。最佳組合為A3B2C1D2，即提取溫度為90 ℃、液料比為20∶1（mL∶g）、初始pH值為2.0，提取時(shí)間為120 min。在此最佳工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，純果膠的平均提取率為6.84%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，因素A的F值為21.63＞F0.05臨界值19.0，對(duì)結(jié)果影響差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明因素A（提取溫度）是影響黃皮純果膠得率的關(guān)鍵性因素，而其他3個(gè)因素的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 黃皮果果膠制品質(zhì)量分析

參照果膠強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 25533—2010《食品添加劑果膠》中涉及的方法對(duì)提取的果膠進(jìn)行檢測(cè)。

由表4可知，黃皮果膠的各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到了國(guó)標(biāo)GB 25533—2010《食品添加劑果膠》的相關(guān)要求，結(jié)果表明黃皮果膠品質(zhì)較好。

表4 黃皮果膠質(zhì)量分析結(jié)果Table 4 Results of quality analysis of pectin from wampee fruit

3 結(jié)論

以黃皮果為原料，利用超聲波進(jìn)行破壁預(yù)處理后，采用鹽酸熱回流提取法制備黃皮果果膠，通過(guò)單因素試驗(yàn)和L（93）4正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.01 mol/L鹽酸為提取黃皮果果膠的最佳提取溶劑，優(yōu)化提取工藝條件為提取溫度90 ℃、液料比20∶1（mL∶g）、初始pH值為2.0，提取時(shí)間120 min。在此最優(yōu)工藝條件下，黃皮果純果膠得率可達(dá)6.84%，半乳糖醛酸含量為76.51%。該工藝條件下所得的黃皮果果膠各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到GB 25333—2010《食品添加劑果膠》要求，說(shuō)明提取工藝參數(shù)可行，果膠質(zhì)量可靠。