鄭海宏，羅 華，侯紅萍*

（山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷030801）

近年來，為滿足消費者新需求，醋產(chǎn)品不斷朝多樣化發(fā)展[1-2]。葡萄醋，作為果醋產(chǎn)品中的一類[3]，在國外已成為備受推崇的食品[4]。葡萄醋是以葡萄、葡萄汁等原料經(jīng)酒精和醋酸雙重發(fā)酵而成[5-7]，這是區(qū)分它與其他醋的主要特征[8]。同時它在抗菌、抗癌、減肥和控制血糖平衡方面發(fā)揮著重要作用[9-10]。但目前，在我國葡萄醋發(fā)展比較緩慢，可能是由于生產(chǎn)規(guī)模不夠大，技術比較落后，原材料利用率低等原因造成。有機酸作為葡萄醋中一類重要的有機化合物，不僅決定了葡萄醋的酸味品質，同時還影響產(chǎn)品的感官特性和穩(wěn)定性[11]。對葡萄醋而言，除了醋酸發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性醋酸外，有機酸同樣是影響其風味的重要指標，但目前多數(shù)的報道集中在葡萄醋菌種的篩選和醋飲品的工藝研究上，對有機酸的研究卻相對較少。

本研究以實驗室自釀赤霞珠葡萄酒為原料，將葡萄酒進行醋酸發(fā)酵，并通過響應面法對醋酸發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在研究適合赤霞珠葡萄醋的發(fā)酵條件，為工業(yè)化、機械化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。并且使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法中的外標法對葡萄醋中的有機酸進行測定[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：滬釀1.01羅旺醋酸桿菌醋酸菌（Acetobacter lovaniense），上海釀造一廠。

葡萄酒（酒精度為13.27%vol，總酸含量為0.52 g/L，揮發(fā)酸含量為0.50 g/100 mL，還原糖含量為3.57 g/100 mL，SO2含量為36.2 mg/L）：實驗室自制。

無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乙酸、草酸（均為色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，酵母膏1 g，碳酸鈣1.5 g，加蒸餾水定容到100 mL，121 ℃滅菌20 min。

有機酸混標液：分別稱取草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸各0.5 g，用超濾水定容至50 mL，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹13]。

1.2 儀器與設備

HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；ST2100pH計：奧豪斯儀器有限公司；JJ124BC分析天平：常熟市雙杰測試儀器廠；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；Thermo FisherU3000高效液相色譜儀-紫外檢測器：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄醋加工工藝流程

種子發(fā)酵液→葡萄原酒（75 ℃加熱殺菌10 min）→葡萄原酒降度→接入母發(fā)酵液→醋酸發(fā)酵→發(fā)酵終止（酸度略有下降）→澄清→滅菌→灌裝→成品

1.3.2 操作要點

種子發(fā)酵液：將斜面保存的醋酸菌菌種在無菌環(huán)境中接種于醋酸培養(yǎng)基中（150 mL）活化，加入4 mL無水乙醇，32 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

葡萄原酒降度：將葡萄捏碎，去掉葡萄皮渣后，葡萄汁進行巴氏殺菌（75 ℃，10 min），吸取葡萄酒上清液并用葡萄汁進行降度，用密度瓶法測定其酒精度。

母發(fā)酵液：將葡萄汁分裝于三角瓶中，無菌條件下接入5%種子發(fā)酵液，放入4 mL無水乙醇，搖勻，置于32 ℃培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液：將母發(fā)酵液按10%加入降度后的葡萄原酒中，進行醋酸發(fā)酵。

通氧量的控制：恒溫振蕩培養(yǎng)箱中設定溫度和轉速。

1.3.3 葡萄醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

分別選取葡萄原酒酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol）、醋酸菌接種量（4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32℃）、通氧量（80 r/min、100 r/min、120 r/min、140 r/min）進行醋酸發(fā)酵單因素試驗，并對醋酸發(fā)酵液進行酸度的測定，直到酸度略有下降為止。

1.3.4 響應面優(yōu)化葡萄醋發(fā)酵工藝

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

以單因素試驗為基礎，固定發(fā)酵溫度為30 ℃，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，以酸度（Y）為響應值，酒精度（X1）、接種量（X2）、通氣量（X3）為響應因素進行優(yōu)化組合，試驗因素與水平見表1。

1.3.5 葡萄醋理化指標的測定

理化指標：主要包括總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、總酯、還原糖、pH和總酯，分別參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》、GB 18187—2000《釀造食醋》、GB/T5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》、GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋的方法》進行測定。

1.3.6 葡萄醋中有機酸的測定

樣品前處理：吸取1 mL葡萄醋樣品，稀釋100倍，并用0.45 μm針頭過濾器過濾后待檢測。

色譜條件：Venusil MP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；進樣體積20 μL；紫外檢測波長210 nm；流動相20 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液。

2 結果與分析

2.1 葡萄醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同酒精度對葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

由圖1可知，4種不同酒精度對發(fā)酵液酸度的影響是不同的，用SPSS分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液酸度的增長在第11天和第12天沒有顯著性差異（P＞0.05）。酒精度在5%vol～7%vol之間，醋酸發(fā)酵旺盛，產(chǎn)酸量較高，可能是由于酒精度增加，引起發(fā)酵液中營養(yǎng)物質的增加，使得醋酸菌生長繁殖加快，發(fā)酵液酸度上升；當酒精度＞7%vol之后，發(fā)酵液的酸度在后期反而降低。所以確定醋酸發(fā)酵的最佳初始酒精度為7%vol。

圖1 不同初始酒精度對發(fā)酵液酸度的影響Fig. 1 Effect of different initial alcohol contents on acidity of fermentation broth

2.1.2 不同接種量對葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

由圖2可知，在前4天的時候，不同的接種量對葡萄醋發(fā)酵液的影響顯著（P＜0.05），在后8天無顯著性差異（P＞0.05）。酸度隨接種量的增大呈先上升后下降的趨勢，在接種量為8%時均達到最高，其中在12 d時達到最大值，為0.59 g/L。當醋酸菌的接種量在4%～8%之間，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的酸度也在增加，當接種量＞8%之后，發(fā)酵液的酸度反而下降，營養(yǎng)物質無法滿足條件下，醋酸菌產(chǎn)生了自溶和老化，所以酸度無法再升高[15]。所以確定醋酸發(fā)酵的醋酸菌的最佳接種量為8%。

圖2 不同接種量對發(fā)酵液酸度的影響Fig. 2 Effect of different inoculum on acidity of fermentation broth

2.1.3 不同通氧量對葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

由圖3可知，發(fā)酵前6天，通氧量對葡萄醋發(fā)酵液酸度的影響顯著（P＜0.05），后6天無顯著性影響（P＞0.05），酸度隨通氧量的增加呈先增長后下降的趨勢。在通氧量＜100 r/min時，發(fā)酵液的酸度隨著轉速的增加不斷增長，在發(fā)酵第11天時，酸度最高為0.58 g/L；通氧量增大，酒精和醋酸的揮發(fā)量也隨之增大，造成原料和產(chǎn)物損失，使得醋酸菌產(chǎn)酸率降低，發(fā)酵液酸度不再增高[16]。所以確定醋酸發(fā)酵的最佳通氧量為100 r/min。

圖3 不同通氧量對發(fā)酵液酸度的影響Fig. 3 Effect of different oxygen contents on acidity of fermentation broth

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對葡萄醋發(fā)酵工藝的影響

由圖4可知，在前11天的影響是顯著的（P＜0.05），之后幾天影響不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵溫度在30 ℃時，發(fā)酵液的酸度達到最高，為0.56 g/L。當發(fā)酵溫度在32 ℃以上時，前期酸度增長無明顯變化（P＞0.05），在11 d后，酸度增長趨于平緩，可能是溫度抑制了醋酸菌生長，使其老化階段提早造成[17-18]。因此，醋酸發(fā)酵過程的最適發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖4 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵液酸度的影響Fig. 4 Effect of different fermentation temperature on acidity of fermentation broth

2.2 響應面試驗優(yōu)化葡萄醋發(fā)酵工藝結果

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及試驗結果

表2 Box-Behnken試驗設計及試驗結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

續(xù)表

由表3可知，該模型的P=0.000 4＜0.01，說明模型極顯著，試驗設計真實可靠；失擬項P=0.549 2＞0.05，表明模型呈顯著性。決定系數(shù)R2=0.960 6，表明在響應值的變化中，有96.06%的可能性是源自于所選因素的變化；它和調整決定系數(shù)R2adj=0.910 0共同說明，在發(fā)酵液中，酸度的實際測定值與預測定值之間擬合度良好。一次項X2與交互項X1X2、X1X3、二次項X12、X32影響極顯著（P＜0.01），X1、X2X3影響不顯著（P＞0.05）。試驗結果得出各因素對葡萄醋酸度的影響順序為X2＞X3＞X1，即接種量＞通氧量＞酒精度。

2.2.2 葡萄醋發(fā)酵

工藝優(yōu)化響應面分析

X1X2、X1X3和X2X3的響應面圖分別見圖5。由圖5可知，交互作用X1X2及X1X3的響應面呈拋物線型，等高線呈橢圓形，說明影響顯著（P＜0.05）。通過Design Expert 8.0.6.1軟件，對所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)的優(yōu)化分析得出，葡萄醋的最佳發(fā)酵條件為酒精度6.56%vol、接種量8%、通氧量108.11 r/min，在此條件下進行發(fā)酵，最高酸度為0.58 g/L。根據(jù)實際可操作條件，得出三個自變量最優(yōu)真實值為酒精度7%vol，接種量8%和通氧量100 r/min，實際測得的總酸含量平均可達到0.56 g/L。

圖5 酒精度、接種量和通氧量交互作用對發(fā)酵液酸度影響的等高線與響應面Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between alcohol content, inoculum and oxygen content on acidity of fermentation broth

2.3 驗證試驗

為了驗證所做試驗結果是否可靠，故在最優(yōu)條件下做3次平行試驗對葡萄醋進行發(fā)酵，得到的酸度平均值為0.58 g/L，與響應面模型有較高的一致性，即Box-Behnken模型有很好的現(xiàn)實意義，能夠預測葡萄醋發(fā)酵條件及其酸度。

2.4 葡萄醋理化指標的測定

表4 葡萄醋理化指標的測定結果Table 4 Determination results of physicochemical indexes of grape vinegar

由表4可知，葡萄醋的還原糖、不揮發(fā)酸、可溶性固形物、總酯、氨基酸態(tài)氮含量分別為0.54 g/100 mL、0.30 g/100 mL、8.98 g/100 mL、8.19 g/100 mL、0.20 g/100 mL，pH為3.50。成品理化指標滿足相關國標要求。

2.5 有機酸的測定

2.5.1 有機酸標樣的色譜圖

混合有機酸的標準溶液的高效液相色譜圖見圖6。由圖6可知，5種有機酸在20 min內全部分離完畢，并且色譜峰分離完全，峰型良好。

圖6 混合標樣的高效液相色譜圖Fig. 6 HPLC of mixed standard samples

2.5.2 線性關系和相關系數(shù)

以峰面積（Y）和相對應的質量濃度（X）制作有機酸的標準曲線并建立回歸方程（見表5），五種有機酸的峰面積和質量濃度的相關系數(shù)R2均＞0.990 0，說明有機酸組分在設定濃度的范圍內，線性關系良好。

表5 有機酸標液的標準曲線Table 5 Standard curves of organic acids standard

2.5.3 葡萄醋中有機酸的分析結果

葡萄醋樣品中包含的有機酸有草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸、琥珀酸等，醋酸菌將酒精轉化成乙酸，所以其含量最為豐富[19]。其中草酸的含量為10.58 g/L、酒石酸的含量為0.46 g/L、蘋果酸的含量為1.34 g/L、乙酸含量為46.82 g/L、琥珀酸的含量為0.14 g/L。與趙方圓等[20]的實驗結果相比，發(fā)現(xiàn)了草酸這一類有機酸，各有機酸濃度也均相對較高。

3 結論

本研究以實驗室赤霞珠葡萄酒為原料，采用單因素和響應面分析方法優(yōu)化葡萄醋的發(fā)酵工藝，得出最佳的工藝條件為初始酒精度7%vol、接種量8%、通氧量為100 r/min，在發(fā)酵12～13 d時酸度不再增長，這時發(fā)酵液的酸度值可達到0.58 g/L。采用高效液相色譜法測定了葡萄醋中的有機酸，草酸、酒石酸、蘋果酸、乙酸和琥珀酸的含量分別為10.58 g/L、0.46 g/L、1.34 g/L、46.82 g/L、0.14 g/L。