張?jiān)埔埃踺W男，凌宏志，宋 剛，平文祥，葛菁萍*

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150080）

木糖的乙醇發(fā)酵是木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的重要因素。以農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)殘留物為代表的天然木質(zhì)纖維素原料中，木糖含量占很大比重，部分微生物可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。因此選育乙醇產(chǎn)量大的菌種，有助于農(nóng)業(yè)殘留物的回收利用并改善環(huán)境。

能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的少數(shù)菌種包括休哈塔假絲酵母（Candida albicans），黃達(dá)明等[1]分別選取木糖、玉米秸稈和葡萄糖對(duì)Candida albicans進(jìn)行單底物發(fā)酵，30 ℃發(fā)酵48 h后乙醇含量分別為15.35 g/L、12.38 g/L和21.06 g/L。江楓等[2]共培養(yǎng)Candida albicans及Saccharomyces cerevisiae，并對(duì)混合菌固定包埋；葡萄糖及木糖混合物為底物、30 ℃發(fā)酵24 h后的乙醇含量為14.89 g/L。李晴等[3]同樣共培養(yǎng)Candida albicans及Saccharomyces cerevisiae，葡萄糖及木糖混合物為底物、30 ℃發(fā)酵24 h后的乙醇含量為21.84 g/L。蔣發(fā)現(xiàn)等[4]在以葡萄糖及木糖混合物為底物的Candida albicans發(fā)酵培養(yǎng)基中添加玉米秸稈烯酸處理液，30 ℃發(fā)酵36 h后乙醇含量為22.5 g/L。余學(xué)軍等[5]以竹粉酶解液作為Candida albicans發(fā)酵底物，最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵60 h后的乙醇含量為11.56 g/L。余恒等[6]以甘蔗渣漿酶解液作為Candida albicans的發(fā)酵底物，30℃發(fā)酵18 h后的乙醇含量為22.98g/L。劉紅梅[7]以蔗糖渣酶水解液作為酵母菌發(fā)酵底物，Candida albicans在30 ℃發(fā)酵48 h后的乙醇含量為15.15 g/L，較Pichia stipits高78.24%。

休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01利用80 g/L木糖在30 ℃條件下發(fā)酵48 h，最多可得15.31 g/L乙醇。該菌株發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇能力有待加強(qiáng)，這就需要對(duì)菌株進(jìn)行改造。物理誘變因操作簡(jiǎn)單、易于環(huán)保及對(duì)人體傷害小等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。物理誘變中常用的誘變方式是紫外線誘變，紫外線會(huì)使生物體DNA中兩個(gè)相鄰的嘧啶共價(jià)連接，形成嘧啶二聚體[8-9]。二聚體的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致生物體DNA中堿基的非正常配對(duì)，從而導(dǎo)致突變。He-Ne激光誘變具有穩(wěn)定性好、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，因此也作為物理誘變方式之一[10]，低頻氦（He）-氖（Ne）激光照射微生物細(xì)胞，可使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)及生理水平的改變[11]；段良和等[12]對(duì)Saccharomyces cerevisiae進(jìn)行He-Ne激光誘變，篩得1株乙醇高產(chǎn)突變株，其乙醇產(chǎn)量較對(duì)照株提高7.40%。微波作為低頻電磁波，場(chǎng)力和轉(zhuǎn)化能的協(xié)同作用導(dǎo)致生物體突變是其作用機(jī)理。電磁波作用于生物體能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物響應(yīng)，導(dǎo)致生物體生理生化功能發(fā)生變化[13-15]。三種物理誘變方式從不同角度改變待測(cè)菌株的基因組成。因此，本研究利用3種誘變（紫外線、He-Ne激光和微波）方式，分別對(duì)出發(fā)菌株HDYXHT-01進(jìn)行誘變，目的在于獲得高產(chǎn)乙醇菌株，并結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果比較不同物理誘變方式對(duì)修哈塔假絲酵母產(chǎn)乙醇的影響，最終確定出最佳物理誘變因子。為提高工作效率并進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行改良工作奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于將農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)殘留物轉(zhuǎn)化為燃料乙醇具有重要的實(shí)際應(yīng)用及節(jié)能環(huán)保價(jià)值[16]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01：由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

木糖（純度99%）：七臺(tái)河市美化木糖有限責(zé)任公司；酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）、磷酸二氫鉀（分析純）、（NH4）2SO4（分析純）、MgSO4·7H2O（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：北京索萊寶科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：上海生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：木糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，蒸餾水500 mL。

木糖發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：木糖40 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.34 g/L，（NH）42SO40.18 g/L，MgSO·47H2O 0.05 g/L，pH 4.8，蒸餾水500 mL。TTC下層培養(yǎng)基：木糖15 g/L，酵母粉2.5 g/L，磷酸二氫鉀1.34 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，（NH4）2SO40.18 g/L，瓊脂10 g/L，pH 4.8，蒸餾水500 mL。

TTC上層培養(yǎng)基：木糖0.25 g，TTC 0.025 g，瓊脂0.75 g，蒸餾水500 mL。

上述培養(yǎng)基均在108 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基均添加2%瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

JT-150 雙人超凈工作臺(tái)：沈陽(yáng)醫(yī)用凈化設(shè)備廠；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO 公司；ZHWY-211C 全溫度恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Coulter AllegarRX-15R 離心機(jī)：德國(guó)Bechman 公司；HH·Ⅱ420-S 恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HPX-87H 色譜柱：美國(guó)BIO-RAD公司：SCL-10A 高效液相色譜：日本島津公司；He-Ne激光器：黑龍江大學(xué)電子工程學(xué)院自制。

1.3 方法

1.3.1 菌種及種子液的制備

菌種活化：接種環(huán)挑取4 ℃保藏的斜面菌種并轉(zhuǎn)接于種子液斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

種子液的制備：活化好的斜面菌種，接于種子液液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，于30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以10%接種量接于木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為80mL/250mL，于30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)48h。

1.3.2 突變株產(chǎn)乙醇能力分析方法

（1）分析方法

發(fā)酵液中乙醇及木糖含量采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)[18-19]。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，3 500 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液用無(wú)菌水稀釋100倍后，取1 mL樣本用于HPLC進(jìn)樣測(cè)定，乙醇出峰時(shí)間為16.26min，木糖出峰時(shí)間為7.06min。測(cè)定結(jié)果需要換算成未稀釋發(fā)酵液成分含量。

HPLC條件：HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），樣品上樣量20 μL，0.005 mol/L H2SO4作為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，色譜柱、示差檢測(cè)器溫度分別為：65 ℃、40 ℃，分析時(shí)間20 min。

（2）物質(zhì)含量計(jì)算公式

式中：y1為乙醇含量，g/L；x1為乙醇峰面積；y2為木糖含量，g/L；x2為木糖峰面積；y3為乙醇得率，g/g；y4為木糖利用率，%。

1.3.3 誘變?cè)囼?yàn)方法

菌懸液制備：取50 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌液3 500 r/min離心20 min，無(wú)菌0.9%NaCl溶液洗滌并重懸菌體，制成濃度為107個(gè)/mL的菌懸液。

（1）紫外誘變

在無(wú)菌條件下取3 mL菌懸液于直徑6 cm且放入無(wú)菌大頭針的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿開(kāi)蓋并置于磁力攪拌器上，15 W紫外燈下30 cm處放置磁力攪拌器。開(kāi)啟磁力攪拌器并開(kāi)始誘變。誘變時(shí)間梯度為0、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s。

（2）He-Ne 激光誘變

取1.5 mL菌懸液于離心管中，3 500 r/min離心20 min后，距離He-Ne激光誘變儀30 cm進(jìn)行照射，誘變儀功率恒定為15W。照射時(shí)間梯度為0、10min、20min、30min、60min、90 min、120 min。

（3）微波誘變

在無(wú)菌試管中加入5 mL制備好的菌懸液，將其放入裝有蒸餾水的燒杯中，保證燒杯中的水位沒(méi)過(guò)試管中菌懸液的刻度。置于微波處理器（功率800 W、頻率2 450 MHz）中，處理時(shí)間梯度為0、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s。

誘變后的菌液，采用10倍稀釋法用無(wú)菌0.9%NaCl溶液稀釋至10-3，取該梯度的菌液100 μL涂布于種子培養(yǎng)基平板上（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3組平行試驗(yàn)），置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)平板上長(zhǎng)出的菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算致死率（紫外線誘變后的該步操作在避光條件下進(jìn)行，避免光復(fù)活）。各物理誘變方式中正突變率最高的誘變時(shí)間確定為最適誘變時(shí)間。

1.3.4 突變株的篩選方法

初篩：采用TTC作為出發(fā)菌株產(chǎn)乙醇能力的顯色劑，待平板長(zhǎng)出菌落后，將10 mL TTC上層培養(yǎng)基傾倒在其上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h[20]。挑取深紅色且菌落較大的突變菌株進(jìn)行突變株復(fù)篩。

復(fù)篩：對(duì)初篩得到的突變株按1.3.1的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵液3 500 r/min、4 ℃離心20 min后，稀釋100倍的上清液用于HPLC檢測(cè)乙醇及木糖含量。選擇乙醇含量及木糖利用率均較高的突變株作為目的菌株。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析按Duncan's新復(fù)極差檢測(cè)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同字母表示處理間差異顯著；“*”代表t檢驗(yàn)表明試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異顯著（P＜0.05），“**”代表t檢驗(yàn)表明試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變

不同紫外線誘變時(shí)間對(duì)菌株HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，該菌株致死率隨紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)漸漸升高，在誘變30 s、60 s時(shí)菌株致死率分別為51.91%、89.82%，70～80 s時(shí)菌株致死率接近100%。

圖1 不同紫外線誘變時(shí)間對(duì)菌株HDYXHT-01致死率的影響Fig. 1 Effect of different ultraviolet mutagensis time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同紫外線誘變時(shí)間對(duì)菌株HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，誘變30～50 s過(guò)程中，正突變率漸漸加大，50 s時(shí)正突變率最大，為6.62%，50 s后突變株正突變率呈下降趨勢(shì)，70 s后正突變率為0。因此，確定紫外線對(duì)菌株HDYXHT-01的最佳誘變時(shí)間為50 s。

圖2 不同紫外線誘變時(shí)間對(duì)菌株HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 2 Effect of different ultraviolet mutagenesis time on mutagenic effect of strain HDYXHT-01

圖3 不同紫外線誘變突變株的木糖利用率Fig. 3 Xylose utilization rate of different ultraviolet mutants

不同紫外線突變株的木糖利用率結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，紫外線突變株的木糖利用率均有下降，下降范圍為0.38%～11.12%。

圖4 不同紫外線誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 4 Ethanol production (A) and yield (B) of different UV mutants

不同紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有不同程度的上升，乙醇產(chǎn)量上升范圍在3.03%～12.88%，乙醇得率上升范圍在5.05%～20.09%。分析造成這種現(xiàn)象的原因是與Candida albicans代謝木糖產(chǎn)乙醇路徑中的關(guān)鍵酶酶活發(fā)生變化有關(guān)。木糖還原酶（xylosereduetase，XR）及木糖醇脫氫酶（xylitol dehydrogenase，XDH）被認(rèn)為是Candida albicans木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶[21]。丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）及乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）被認(rèn)為是Candida albicans乙醇生成途徑的兩種關(guān)鍵酶。本試驗(yàn)中，紫外線突變株的木糖利用率均有下降，表明突變菌株代謝木糖的能力減弱，進(jìn)一步推測(cè)紫外線可能對(duì)Candida albicans木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶酶活具有削弱作用；紫外線突變株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有不同程度的上升，表明突變菌株生成乙醇能力加強(qiáng)，進(jìn)一步推測(cè)紫外線可能對(duì)Candida albicans乙醇生成路徑中的兩種關(guān)鍵酶酶活具有增強(qiáng)作用。其中菌株ZW-6的乙醇產(chǎn)量最大，達(dá)9.29 g/L，乙醇得率為0.239 8 g/g，較原始菌株HDYXHT-01分別提高12.88%和17.78%。

2.2 He-Ne激光誘變

不同He-Ne激光誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，前30 min內(nèi)誘變對(duì)菌株的致死效應(yīng)逐漸增大，致死率逐漸提高，由32.12%上升至46.36%。誘變30 min后，致死率減小，表明菌體恢復(fù)生長(zhǎng)。隨著激光照射時(shí)間加長(zhǎng)，原始菌株細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)效果越發(fā)明顯，誘變90 min后致死率為負(fù)值，隨著照射時(shí)間進(jìn)一步加長(zhǎng)，原始菌株生長(zhǎng)繁殖再次受到抑制，誘變120 min時(shí)致死率為-33.61%。結(jié)果表明，He-Ne激光可影響原始菌株的生理活性，加快或抑制其生長(zhǎng)繁殖。

圖5 不同He-Ne激光誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01致死率的影響Fig. 5 Effect of different He-Ne laser mutagenic time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同He-Ne激光誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，誘變前60 min，正突變率均較高，誘變10 min時(shí)正突變率為48.62%，誘變30 min時(shí)正突變率為37.61%，誘變60 min時(shí)正突變率為24.45%。由此可見(jiàn)，在He-Ne激光誘變的過(guò)程中，突變菌株正突變率普遍較高，可能是Candida albicans細(xì)胞內(nèi)乙醇生成路徑中關(guān)鍵酶的生理活性與激光劑量直接相關(guān)。

圖6 不同He-Ne激光誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 6 Effect of different He-Ne laser mutagenesis time on mutagenic effects of strain HDYXHT-01

不同He-Ne激光誘變突變株的木糖利用率結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，He-Ne激光誘變突變株，木糖利用率均有上升，上升范圍為1.69%～44.77%。表明突變株的木糖代謝能力增強(qiáng)，進(jìn)一步推測(cè)造成這種現(xiàn)象的原因可能是He-Ne激光對(duì)原始菌株木糖代謝途徑的兩種關(guān)鍵酶酶活具有增強(qiáng)作用。

圖7 不同He-Ne激光誘變突變株的木糖利用率Fig. 7 Xylose utilization rate of different He-Ne laser mutagenized mutants

不同He-Ne激光誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 不同He-Ne激光誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 8 Ethanol production (A) and yield (B) of different He-Ne laser mutagenized mutants

由圖8可知，突變菌株的乙醇產(chǎn)量及乙醇得率均有提高。提高最多的為菌株HN-3，乙醇產(chǎn)量達(dá)17.34 g/L，乙醇得率為0.351 8 g/g，較原始菌株分別提高39.61%和44.75%。

2.3 微波誘變

不同微波誘變處理時(shí)間對(duì)HDYXHT-01致死率的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，該菌株致死率隨誘變時(shí)間的增長(zhǎng)漸漸加大。誘變40 s時(shí)致死率為44.94%，誘變80 s時(shí)致死率達(dá)67.29%；誘變140 s后致死率上升幅度減小且接近100%。

圖9 不同微波誘變處理時(shí)間對(duì)HDYXHT-01致死率的影響Fig. 9 Effect of different microwave mutagenesis time on lethal rate of strain HDYXHT-01

不同微波誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，誘變40～100 s過(guò)程中，正突變率漸漸加大，100 s時(shí)正突變率最大為20.44%。100 s后正突變率呈下降趨勢(shì)，160 s時(shí)正突變率達(dá)到最低為3.03%。因此，確定微波對(duì)菌株HDYXHT-01的最佳誘變時(shí)間為100 s。

圖10 不同微波誘變時(shí)間對(duì)HDYXHT-01誘變效應(yīng)的影響Fig. 10 Effect of different microwave mutagenesis time on mutagenic effects of strain HDYXHT-01

不同微波誘變突變株的木糖利用率結(jié)果見(jiàn)圖11。由圖11可知，相比于原始菌株，就木糖利用率而言，菌株WB-4、WB-6、WB-7分別提高3.43%、2.15%、3.61%；其余6株微波突變菌株木糖利用率均有下降，下降范圍在3.11%～15.19%。

不同微波誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖11 不同微波誘變突變株的木糖利用率Fig. 11 Xylose utilization rate of different microwave mutagenized mutants

圖12 不同微波誘變突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）Fig. 12 Ethanol production (A) and yield (B) of different microwave mutagenized mutants

由圖12可知，就乙醇產(chǎn)量而言，除菌株WB-8乙醇產(chǎn)量下降3.01%外其余突變株均有提高，范圍在2.94%～11.31%，進(jìn)一步推測(cè)造成這些現(xiàn)象的原因是微波可能對(duì)出發(fā)菌株木糖代謝途徑及乙醇生成路徑中的幾種關(guān)鍵酶酶活的增強(qiáng)或削弱作用具有隨機(jī)性，其中WB-3的乙醇產(chǎn)量最高，達(dá)17.03 g/L，較原始菌株提高11.31%；就乙醇得率而言，各突變株的乙醇得率均有提高，范圍在0.74%～20.36%。

3 幾種物理誘變方法的比較

不同突變株的木糖利用率結(jié)果見(jiàn)圖13。由圖13可知，菌株HN-3的木糖利用率較原始菌株提高0.13%，菌株ZW-6、WB-3的木糖利用率分別較原始菌株降低1.92%、0.97%。不同突變株的乙醇產(chǎn)量（A）及得率（B）結(jié)果見(jiàn)圖14。

圖13 不同突變株的木糖利用率Fig. 13 Xylose utilization rate of different mutants

由圖14可知，菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇產(chǎn)量及得率均有不同程度的上升。菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇產(chǎn)量分別為17.44 g/L、18.49 g/L、18.11 g/L，分別較原始菌株提高13.91%、20.77%、18.29%；菌株ZW-6、HN-3、WB-2的乙醇得率分別為0.353 7 g/g、0.382 8 g/g、0.371 4 g/g，分別較原始菌株提高13.80%、23.17%、19.50%。

4 結(jié)論

本研究以休哈塔假絲酵母（Candida albicans）HDYXHT-01作為出發(fā)菌株，采用紫外線、He-Ne激光、微波三種不同的物理誘變方式對(duì)其進(jìn)行誘變，目的在于選育高產(chǎn)乙醇菌株的同時(shí)確定最佳的物理誘變因子。結(jié)果表明，與紫外線及微波各誘變菌株相比，He-Ne激光誘變菌株的正突變率高，激光照射10 min時(shí)，正突變率高達(dá)48.62%；He-Ne激光誘變菌株的木糖利用率、乙醇產(chǎn)量、乙醇得率均提高最多，提高的范圍最大，分別較原始菌株提高1.69%～44.77%、13.12%～40.59%、29.73%～47.75%。因此，確定He-Ne激光為最佳物理誘變因子。最佳物理誘變因子的確定為提高科研工作效率及進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行改造工作奠定基礎(chǔ)；木糖利用率及乙醇產(chǎn)量高的突變菌株的獲得，在為利用休哈塔假絲酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙醇提供數(shù)據(jù)參考的同時(shí)，有助于農(nóng)業(yè)殘留物的回收利用做到節(jié)能減排，并具有一定意義的環(huán)保價(jià)值。