唐湘華，楊云娟，李俊俊，韓楠玉，慕躍林，吳 倩，黃遵錫*

（1.云南師范大學(xué) 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南 昆明650500；2.云南省酶工程技術(shù)研究中心，云南 昆明650500）

固定化技術(shù)是現(xiàn)代工業(yè)上廣泛使用的一類新型生物技術(shù)[1-2]，酵母的固定化研究利用物理、化學(xué)等方法將酵母細(xì)胞約束或者限制在一定的空間內(nèi)，使細(xì)胞仍能保留其催化活性，并且具有能被反復(fù)利用的活力。釀酒酵母固定化細(xì)胞具有代謝快、反應(yīng)快、抗污染能力強(qiáng)，能夠連續(xù)使用，有利于產(chǎn)物分離的特點(diǎn)，并且逐漸已被廣泛的應(yīng)用于食品與發(fā)酵工業(yè)中[3-6]。常用的固定化包埋劑采用海藻酸鈉、卡拉膠、羥甲基纖維素鈉等多糖膠[7-9]。魔芋膠[10-11]是一種黏度較高的新型多糖膠，魔芋粉溶解形成的膠狀多糖細(xì)膩，和海藻酸鈉組合具有一定的柔軟性和圓滑性，顆粒疏松多孔，便于酵母呼吸作用，能通過縫隙利用游離的單糖作能源維持生命活動。

魔芋中含有大量的魔芋多糖，為天然高分子化合物，具有較好的黏性，能與水結(jié)合成膠體溶液，可用于食品穩(wěn)定劑[11-14]、增稠劑[15]、膠凝劑[16]、石油萃取黏膠劑[17-18]。魔芋中的多糖主要為葡甘露聚糖，其水解產(chǎn)物魔芋寡糖，現(xiàn)已逐步被用于改善人體腸道內(nèi)環(huán)境，通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群來治療當(dāng)前大量的慢性疾病[19-21]，解決腸道微生物菌群失調(diào)間接與其他疾病相關(guān)的問題[22-25]。魔芋粉水解產(chǎn)物中會有還原性單糖[26]的存在，降低寡糖的純度和使用效果，不利于市場的開發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)采用海藻酸鈉和魔芋粉組合固化交聯(lián)劑，包埋高濃度的釀酒酵母，通過三級反應(yīng)柱對酶法水解的魔芋粉水解產(chǎn)物進(jìn)行單糖去除實(shí)驗(yàn)，采用生物降解法快速、高效降解，避免較多副產(chǎn)物的生成和縮短樣品處理周期。實(shí)驗(yàn)分析了固定化酵母細(xì)胞的活性能力；采用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法測試了固定化酵母對魔芋粉水解產(chǎn)物中單糖的去除，為后續(xù)低聚糖混合物的分離、純化提供可行性技術(shù)路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GY-1：云南師范大學(xué)生科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室通過離心噴霧干燥設(shè)備制備。

β-甘露聚糖酶（10 000 U/g）：昆明愛科特生物科技有限公司；海藻酸鈉（分析純）：上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；魔芋精粉（食品級）：麗江玉元食品有限公司；CaCl（2分析純）：成都臨江化工廠；葡萄糖（分析純），3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露六糖（純度均為≥95%）：南京草本源生物科技有限公司；魔芋膠（含有2%～3%的還原糖）：實(shí)驗(yàn)室通過β-甘露聚酶水解20%濃度的魔芋粉制備形成的低聚糖水解液。

1.2 儀器與設(shè)備

CJJ-931四聯(lián)磁力加熱攪拌器：江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；CX22LEDRFSI奧林巴斯顯微鏡：日本OLYMPUS公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CP1502電子稱：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TGL-16B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；NDJ-1旋轉(zhuǎn)黏度計：上海群昶科學(xué)儀器有限公司；多級離子交換柱1.8 cm×35 cm×3根（每根裝液體積為32.0 mL）：上海方畦儀器有限公司；S100-11B+TH1013型微量泵：保定迪創(chuàng)電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酵母GY-1的制備

取100 mL的40 ℃水溶解酵母，在磁力攪拌器上混合攪拌30 min，再稱取1%的海藻酸鈉和相應(yīng)比例的魔芋粉（各組合比例見表1），混合，加入混有酵母粉水溶液中，攪拌混合1 h，使用微量泵滴到4%CaCl2溶液中，在低溫條件下交聯(lián)反應(yīng)10 h，觀察固定化酵母顆粒硬度、形狀、大小、顆粒光滑程度。

表1 固定化酵母GY-1的海藻酸鈉、魔芋粉及酵母配比Table 1 Ratio of sodium alginate, konjac powder and yeast for immobilized yeast GY-1

1.3.2 分析檢測

（1）還原糖含量的測定

取魔芋粉水解產(chǎn)物進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取3支試管，兩支試管中每支試管裝入0.2 mL稀釋液，一支試管裝入0.2 mL蒸餾水，每支試管加入3 mL DNS試劑，沸水浴條件下煮沸5 min，冷卻，補(bǔ)水使反應(yīng)體積總體積為15 mL，在波長540 nm條件下測定吸光度值，計算酶解液中還原糖的含量。

（2）糖度的測定

糖度測定是一種快速的方法，可通過在線測定，比還原糖測定快捷，實(shí)驗(yàn)中采用糖度計對寡糖溶液進(jìn)行監(jiān)控，為工業(yè)化生產(chǎn)檢測提供快捷思路，簡化生產(chǎn)環(huán)節(jié)。以水為空白校正調(diào)零，取水解液放在糖度計測得。

（3）魔芋膠黏度的測定

分別取0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g魔芋精粉加入100 mL的60 ℃熱水中，混合均勻，B型磁力攪拌子在溶液中攪拌4 h，溶液溶脹混合均勻，冷卻至室溫（25 ℃），使用轉(zhuǎn)子黏度計測定黏度。

（4）固定化酵母死亡率的測定

實(shí)驗(yàn)采用美蘭法測定固定化酵母的死活細(xì)胞，將包埋形成的不同濃度的固定化酵母GY-1顆粒用研缽搗碎后，取酵母液0.2 mL放入試管中，加入1.0 mL美蘭試劑，混合均勻，取樣做水封片，在40×高倍鏡下觀察酵母細(xì)胞著色情況，如果細(xì)胞染成藍(lán)色表明是死細(xì)胞，計算視野中細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞個數(shù)。

（5）固定化酵母活性的測試

配制3%葡萄糖和0.5%（NH）42SO4的培養(yǎng)基溶液100 mL裝入300 mL的錐形瓶中，共配制13瓶，包扎進(jìn)行滅菌、冷卻；再分別稱取5.0 g、10.0 g、15.0 g、20.0 g固定化酵母添加到培養(yǎng)液中，每個梯度做3瓶，最后設(shè)置一組不添加固定化酵母顆粒作為空白對照互組；實(shí)驗(yàn)樣品全部在30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，分別在6 h、12 h、24 h、48 h取樣測定反應(yīng)液中的還原糖和稱瓶質(zhì)量計算二氧化碳的產(chǎn)生量。

1.3.3 柱式反應(yīng)器流速對固定化酵母利用單糖能力的影響

將三個反應(yīng)柱串聯(lián)固定在鐵架臺上，每個反應(yīng)柱中裝滿固定化酵母顆粒，進(jìn)口和出口都置于裝有糖液的燒杯中，利用微量泵對糖液進(jìn)行循環(huán)，當(dāng)糖液依次經(jīng)過反應(yīng)柱時，可利還原單糖滲透進(jìn)入顆粒中被膠粒中的酵母吸附利用，從而達(dá)到降解利用單糖的目的。采用將柱子首尾相連，利用微量泵聯(lián)結(jié)形成回路，分別在2.5 mL/min、5.0 mL/min和7.5 mL/min的流速條件下，進(jìn)行固定化酵母利用單糖能力測試，以糖度計快速測定反應(yīng)柱中的糖度，通過糖度的下降程度反映流速對固定化酵母利用單糖能力的影響，其工藝流程見圖1。

圖1 固定化酵母利用單糖工藝流程Fig. 1 Technological process of monosaccharide utilized by immobilized yeast

1.3.4 不同魔芋膠濃度對固定化酵母利用單糖能力的影響

取魔芋粉制備的高濃度魔芋寡糖溶液配制2%、4%、6%、8%的溶液各500 mL，在30 ℃的水浴鍋中保溫，通過微量泵連接到柱式反應(yīng)器中進(jìn)行固定化酵母利用單糖實(shí)驗(yàn)，每隔60 min取100 μL測定還原糖，考察不同的魔芋膠濃度對固定化酵母利用單糖能力的影響。

1.3.5 固定化酵母利用單糖分析

取β-甘露聚糖酶在50 ℃水解10%魔芋50 min，升溫至90 ℃保溫10 min滅酶、過濾、離心，取上清液過0.22 μm濾膜，獲得點(diǎn)樣樣品；取離心的β-甘露聚酶水解液100 mL，溫度保溫控制在30 ℃，過串聯(lián)反應(yīng)柱，通過微量泵控制泵流速為2.5 mL/min，循環(huán)反應(yīng)40 min，取過濾柱Z3的樣品離心，并對離心上清液過0.22 μm濾膜，獲得點(diǎn)樣樣品，按照薄層層析（TLC）法分析產(chǎn)物組成；標(biāo)準(zhǔn)品為甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，其他樣品為葡聚糖酶、纖維素酶的水解產(chǎn)物作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋膠黏度分析

魔芋粉溶解到水中形成高黏度的魔芋膠多糖，流動性較差，具有包埋劑的效果，而且魔芋膠具有潤滑性，制備的顆粒具有一定的硬度和光滑度。實(shí)驗(yàn)分別取0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g魔芋粉加入100 mL熱水中，溶解形成魔芋膠，檢測不同濃度的魔芋膠黏度，結(jié)果見圖2。由圖2可知，2%的魔芋膠黏度能達(dá)到30 000 mPa·s以上，呈膠狀，無流動性。

圖2 不同魔芋膠粉含量對黏度的影響Fig. 2 Effect of different konjac power concentrations on viscosity

2.2 固定化酵母顆粒物理性能比較

選用海藻酸鈉和魔芋粉作為固化交聯(lián)劑，并固定海藻酸鈉的濃度為1%，調(diào)整不同濃度魔芋粉的配比分析顆粒的光滑度和硬度，并對包埋酵母的數(shù)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，添加10%和15%酵母粉進(jìn)行固定化制備形成的顆粒硬度較柔軟，不利于使用；而添加1%酵母粉進(jìn)行固定化制備形成的顆粒硬度合適，但包埋的酵母個數(shù)少，也不利于酵母快速利用單糖，縮短生產(chǎn)工藝時間。在對5%酵母粉進(jìn)行固定化制備形成的顆粒進(jìn)行分析，表明加入2%的魔芋粉形成的顆粒較好，顆粒均勻，粒度平均直徑為4～5 mm。采用美蘭法測定固定化酵母GY-1的死亡率，1%固定化酵母顆粒中死亡率在17%～20%；10%固定化酵母顆粒中死亡率在15%～29%，而5%固定化酵母死亡率在9%～11%。根據(jù)酵母顆粒硬度、光滑程度和酵母細(xì)胞的死亡率，綜合考慮選用5%的酵母+1%海藻酸鈉+2%魔芋粉作為固定化顆粒配比組合來制備固定化酵母GY-1。

表2 固定化酵母GY-1顆粒物理形態(tài)分析Table 2 Physical morphology analysis of immobilized yeast GY-1 particles

續(xù)表

2.4 固定化酵母GY-1利用還原單糖能力測定

通過添加固定化酵母顆粒到3%的葡萄糖溶液中進(jìn)行靜置培養(yǎng)，分析固定化酵母利用還原單糖的能力測試，培養(yǎng)時間為48 h，結(jié)果見圖3。由圖3A可知，培養(yǎng)前后還原糖含量差異較大，48 h后固定化酵母添加量為20%的反應(yīng)瓶中，還原糖含量由30 mg/mL下降至10 mg/mL左右，還原糖利用率為66%；由圖3B可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，二氧化碳產(chǎn)生量在穩(wěn)定增加，表明固定化酵母的降解能力沒有因?yàn)榘穸鴨适А?/p>

圖3 固定化酵母GY-1對還原單糖的利用能力Fig. 3 Utilization capacity of immobilized yeast GY-1 on reducing monosaccharides

2.5 流速對固定化酵母GY-1利用單糖的影響

為縮短固定化酵母利用單糖的周期，實(shí)驗(yàn)采用動態(tài)法進(jìn)行降解，采用三級柱式反應(yīng)器進(jìn)行研究酵母對單糖的分解能力。選用反應(yīng)體系總體積100 mL魔芋寡糖離心溶液，糖度為12.3°Bx，分別通過Z1柱、Z2柱和Z3柱，通過微量蠕動泵采用2.5 mL/min、5.0 mL/min和7.5 mL/min 的流量進(jìn)入反應(yīng)柱，單個整個循環(huán)時間為分別為40 min、20 min、13.8 min。由圖4可知，采用蠕動泵進(jìn)行動態(tài)循環(huán)，糖液的流速越快，酵母和物料接觸時間短，導(dǎo)致柱中的還原糖分解緩慢，相應(yīng)的柱Z1、柱Z2和柱Z3的糖濃度具有較大差異，柱Z1、柱Z2和柱Z3的溶液中還原糖逐漸降低。研究發(fā)現(xiàn)，寡糖溶液的流量對酵母利用有影響。由圖4a可知，流量為2.5 mL/min時，經(jīng)過40 min的平衡和固定化酵母的吸附、利用，糖的濃度曲線趨于平衡，平緩降解，糖度為10°Bx；由圖4b可知，流速為5 mL/min時，相應(yīng)的寡糖濃度變?yōu)?1.3 °Bx；由圖4c可知，流速為7.5 mL/min時，相應(yīng)的寡糖濃度變?yōu)?1.3 °Bx。所以，過反應(yīng)柱的流量大，循環(huán)時間短，有利于還原糖的輕度降解。由圖4d可知，單位時間柱式反應(yīng)器降解還原糖的效率分析可以看出，采用低流量水解效率要高于高流量水解效率。因此，實(shí)驗(yàn)選擇2.5 mL/min流速用于反應(yīng)柱去除單糖的研究參數(shù)。

圖4 流速對固定化酵母降解還原糖能力的影響Fig. 4 Effect of flow rate on reducing sugars degradation of immobilized yeast

2.6 魔芋寡糖濃度對固定化酵母利用單糖能力的分析

由圖5可知，2%、4%、6%、8%濃度的寡糖液中，還原糖含量隨著柱式反應(yīng)器中酵母的利用程度呈下降趨勢，形成的曲線呈線性關(guān)系。通過對每個濃度的降解曲線進(jìn)行線性擬合，得方程關(guān)系見表4。由表4可知，斜率Ka＞Kb＞Kc≈Kd可以看出采用固定化酵母利用還原糖，其降解能力平緩溫和，低濃度的寡糖降解效率稍高于高濃度，但隨著濃度的增加，降解的效率是趨于一致的，而且由曲線呈線性關(guān)系可知該固定化酵母水解溫和，可根據(jù)曲線控制酵母的生物轉(zhuǎn)化時間。由于采用5%的酵母制作的固定化顆粒，酵母濃度較高，但由于酵母細(xì)胞處于包埋狀態(tài)，沒有過快的增殖效應(yīng)，水解平緩，降解的還原糖趨勢是穩(wěn)定的，其降解曲線呈線性關(guān)系。濃度越高，單糖利用效率越趨近。因此，完全可在高濃度的寡糖溶液直接添加固定化處理，有利于生產(chǎn)成本的降低。

圖5 固定化酵母對還原糖降解的曲線方程Fig. 5 Degradation curve of reducing sugar by immobilized yeast

表4 固定化酵母對還原糖降解曲線Table 4 Degradation curve equations of reducing sugar by immobilized yeast

為了縮短固定化酵母利用魔芋寡糖溶液中的單糖時間，實(shí)驗(yàn)分析了6 h的酵母利用單糖的能力，結(jié)果見圖6。

圖6 還原糖降解率的變化趨勢Fig. 6 Changing trend of degradation rate of reducing sugars

由圖6可知，6 h后在2%、4%、6%、8%的寡糖溶液中還原糖含量分別下降了（42.77±1.70）%、（39.53±1.69）%、（38.83±1.73）%、（38.03±1.68）%，表明通過串聯(lián)柱式反應(yīng)器能在短時間內(nèi)有效降解魔芋寡糖中的單糖，避免其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生，縮短了產(chǎn)品生產(chǎn)周期。

2.7 魔芋寡糖產(chǎn)物的分析

根據(jù)β-1,4糖苷鍵的水解特性，選擇纖維素酶、β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶進(jìn)行了水解魔芋粉，對比水解產(chǎn)物中還原單糖的濃度。由圖7可知，選用的纖維素酶、β-葡聚糖酶和β-甘露聚糖酶水解的產(chǎn)物中都存在單糖；酵母固定化采用高密度酵母進(jìn)行酵解，設(shè)計時間短，無酒精等副產(chǎn)物產(chǎn)生，但有少量有機(jī)酸產(chǎn)物，后期通過膜處理，保證了產(chǎn)品的純度和品質(zhì)。甬道11、12為甘露聚糖酶水解產(chǎn)物通過固定化酵母處理，單糖被充分利用消耗掉，沒有出現(xiàn)單糖的斑點(diǎn)，表明單糖已經(jīng)被酵母利用，選用固定化酵母處理的工藝是可行的。

圖7 魔芋寡糖水解產(chǎn)物的TLC分析結(jié)果Fig. 7 TLC analysis results of konjac oligosaccharides

3 結(jié)論

本研究針對魔芋粉水解產(chǎn)物中伴隨著還原單糖的出現(xiàn)，采用固定化的釀酒酵母進(jìn)行生物法去除單糖，同時利用固定化大顆粒特性進(jìn)行產(chǎn)物分離，采用魔芋粉、海藻酸鈉和酵母粉劑按照一定比例混合制備固定化酵母。實(shí)驗(yàn)分析了固定顆粒的硬度、光滑程度、包埋的酵母數(shù)量、死亡率、酵母利用單糖活力測定和固定化酵母在三級反應(yīng)柱內(nèi)受泵流量影響還原糖降解的差異分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2%的魔芋粉+1%海藻酸鈉+5%酵母粉組合形成的固定化酵母顆粒均勻，直徑為4～5 mm，包埋的酵母死亡率低于10%；在充滿固定化酵母顆粒的反應(yīng)柱中，通過動態(tài)法去除寡糖中的還原性單糖，選用低速流量為2.5 mL/min對100 mL魔芋水解液中的單糖和固定化酵母循環(huán)接觸，加大接觸面積，40 min后溶液中的糖度由12°Bx下降至10°Bx；對酵母處理的水解液通過薄層層析（TLC）法檢測，以沒有酵母利用的樣品為對照進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)固定化酵母GY-1能夠利用單糖（葡萄糖、甘露糖），對二糖以上聚合體不能利用，可達(dá)到純化魔芋寡糖的目的，表明該工藝技術(shù)路線是可行的。根據(jù)該技術(shù)路線進(jìn)行放大工藝，完全可以用于其他種類單糖去除工藝，對產(chǎn)品的純化、簡化工藝路線具有一定的指導(dǎo)意義。