尚雪嬌，折米娜，鄧長陽，廖 華，趙 楠，郭 壯，4*

（1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽441053；2.恩施市農業(yè)局，湖北 恩施445000；3.四川省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，四川 成都610066；4.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施445000）

泡辣椒是一種流行于四川、湖南和貴州等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒產品[1]，其主要利用辣椒表面附著的微生物自然發(fā)酵而成[2]。由于傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作環(huán)境開放，使得各類產品中的微生物具有多樣性[3]。鐘燕青[4]研究發(fā)現，湖南地區(qū)自然發(fā)酵剁辣椒中的乳酸菌主要為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus breris），同時沙漠等[5]從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出兩株產酸量高、生長良好且適用于發(fā)酵辣椒試驗的菌株，分別為L.plantarum和腸膜串球菌（Streptococcus faecalis）。周俊良[6]在貴州地區(qū)市售泡辣椒和農家自制醬辣椒產品中篩選出4株適用于發(fā)酵辣椒制品制作的乳酸菌，分別為雙發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus bifermentans）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）和食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans），然而關于湖北恩施地區(qū)泡辣椒中微生物多樣性的研究報道尚少。

相對于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方式，Illumina MiSeq第二代高通量測序技術可以獲得不同環(huán)境條件下微生物的群落結構，不僅能夠檢測到低豐度的微生物，而且具有很高的可信度和準確度[7]。同時聚合酶鏈式反應結合變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）是一種新型且不依賴于培養(yǎng)的分子生物學技術，其可以直接提取微生物的宏基因組，通過電泳圖來檢測和鑒定自然環(huán)境或人工環(huán)境中微生物的種類[8]。Illumina MiSeq技術和PCR-DGGE技術改善了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法中耗時長和工作量大等缺點，同時具有快速和簡便且重復性好的特點，被廣泛應用于發(fā)酵食品[9-10]、肉制品[11-12]、腸道[13-14]和土壤[15-16]微生態(tài)研究等領域。

因此，本研究采用MiSeq高通量測序技術與PCR-DGGE技術相結合的方法對恩施地區(qū)3種泡辣椒中微生物的多樣性進行解析，同時利用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法及分子生物學技術對其中所含的乳酸菌進行分離鑒定。以期全面解析恩施市傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中細菌的多樣性，同時對恩施地區(qū)發(fā)酵食品中乳酸菌的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

3種泡辣椒樣品（編號分別為LJS01、LJS02和LJS03，泡制時間均在30 d左右）：采購于恩施市土橋壩菜市場。

1.1.2 試劑

三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；D5625-01脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA marker、PCR清潔試劑盒：京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、pMD18-T vector：大連寶生物技術有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態(tài)細胞：鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所自制；PCR引物合成由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成，引物信息如表1所示。

表1 本實驗采用的引物信息Table 1 Information of primers used in the experiment

1.2 儀器與設備

MiSeq PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務器：美國DELL公司；CT15RE冷凍離心機：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cycler PCR儀：美國AB公司；NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度計：美國Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美國Bio-Rad公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站：英國DWS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡辣椒樣品宏基因組提取與檢測

采用OMEGA D5625-01試劑盒提取3種泡辣椒樣品的宏基因組，采用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并用NanoDrop超微量分光光度計測定其DNA的濃度。

1.3.2 泡辣椒樣品細菌16S rRNA PCR擴增及MiSeq高通量測序

參照沈馨等[17]的方法對泡辣椒樣品中細菌的16S rRNA基因進行PCR擴增及MiSeq高通量測序。PCR擴增體系：5×PCR緩沖液4.0 μL，dNTP mix 2.0 μL，正反向引物338F/806

R各0.8 μL，rTaq酶0.4 μL，DNA模板10 ng，無菌超純水補充至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共30次循環(huán)；72℃再延伸10min。其擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后將濃度稀釋至100 nmol/L，寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行MiSeq高通量測序。

1.3.3 序列拼接及質量控制

參照周書楠等[18-19]的方法，根據成對序列之間的重疊關系，將雙端序列拼接成一條序列；其次根據barcode將所有序列劃分到各個樣品并對序列方向進行校正，最后切除序列的barcode和引物。使用QIIME v1.7.0分析平臺對拼接及質控成功的序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分和物種鑒定（包括界、門、綱、目、科和屬水平），并計算各分類單元的相對含量。

1.3.4 泡辣椒中乳酸桿菌多樣性解析

對乳酸桿菌的16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（LacF-GC）、反向引物（LacR）和rTaq各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，無菌超純水補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用8%聚丙烯酰胺凝膠、變性劑梯度為35%～52%的變性劑（尿素和去離子甲酰胺）進行DGGE。電泳溫度為60 ℃，電泳緩沖液為0.5×TAE，上樣量為10 μL，120 V條件下運行80 min后，80 V條件下運行13 h。電泳結束后，對凝膠進行硝酸銀染色，對DGGE圖進行觀察、掃描、拍照并找出優(yōu)勢條帶切膠回收?；厥盏腜CR擴增產物用不含GC夾子的引物LacF和LacR進行PCR擴增，PCR擴增體系及條件與上述方法相同。將清潔的PCR擴增產物與pMD18-T載體連接后轉化到E.coli Top10感受態(tài)細胞中，經單克隆鑒定合格后送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。將測序結果除去兩端載體的序列，然后使用BioEdit軟件進行拼接，拼接后在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進行同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 泡辣椒中乳酸菌的分離與鑒定

將泡辣椒樣品進行倍比稀釋并涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取有透明圈的單菌落進行純化、革蘭氏染色和保藏。采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法[20]提取各菌株的DNA，以其為模板進行16S rRNA PCR擴增。在張魯冀等[21]的方法上稍作修改，PCR擴增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，正向引物（27F）、反向引物（1495R）、rTaq酶和DNA模板各0.5 μL，無菌超純水補充至25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將清潔的PCR擴增產物按照方法1.3.4處理并對測定結果進行拼接和比對。

1.3.6 數據處理

通過Origin 8.5軟件對平均相對含量＞1.0%的細菌屬進行柱狀圖的繪制，維恩（Venn）圖由在線網站（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進行繪制。利用BioEdit軟件和MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 基于MiSeq高通量測序技術泡辣椒細菌多樣性的研究

3種泡辣椒樣品中共產生了131 480條16S rRNA高質量序列，平均每種樣品產生43 826 條16S rRNA高質量序列。根據100%的相似性進行序列劃分共得到78 050條代表性序列，根據序列的97%相似性進行OTU劃分后，共得到8 879個OTU，每種樣品平均得到2 959個OTU。使用Ribosomal Database Projec（tRDP）和Greengenes數據庫對序列進行同源性比對，將所有的序列鑒定為10個門、18個綱、42個目、82個科和177個屬。

在門水平上，3種泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌門分別為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為85.70%和12.59%。在屬水平上，有10.88%的序列不能被鑒定，其中平均相對含量＞1.0%的屬如圖1所示。

由圖1可知，泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和明串球菌屬（Leuconostoc），其平均相對含量分別為67.37%、7.69%、1.99%、1.16%、1.08%和1.02%。由此可知，隸屬于Firmicutes的Lactobacillus為泡辣椒中的優(yōu)勢屬。利用MiSeq高通量測序方法，韓俊燕等[20]對發(fā)酵辣椒中微生物多樣性進行分析，結果發(fā)現Firmicutes為所有樣品的優(yōu)勢細菌門，其含量＞50%，進一步研究得知，Lactobacillus和Weissella為優(yōu)勢細菌屬。JUNG J Y等[22]使用454 GS FLX Titanium測序系統(tǒng)發(fā)現韓國泡菜中主要的細菌屬為Leuconostoc、Lactobacillus和Weissella。

圖1 泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌屬Fig. 1 Bacterial genera with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

在OTU水平上，進一步統(tǒng)計OTU在3種泡辣椒樣品中出現的頻率，結果如圖2所示。

圖2 基于OTU水平的Venn圖Fig. 2 Venn diagram based on OTU level

由圖2可知，3種泡辣椒樣品中共有23個核心OTU，僅占OTU總數的0.2%，但包含了95 978條序列，占總序列數的73.0%。在23個核心OUT中，8個核心OTU在3種泡辣椒樣品中的平均相對含量＞1.0%，分別為OTU1140、OTU2282、OTU3351、OTU7763、OTU326、OTU227、OTU5266和OTU 7746。進一步構建了8個核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖3所示。

圖3 泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of core OTU with average relative abundance more than 1.0% in the pickled chili samples

由 圖3 可 知，OTU1140 和OTU2282 與Lactobacillus acidifarinae聚為一類，OTU3351與Lactobacillus namurensis聚為一類，OTU7763和Lactobacillusparafarraginis聚為一類，OTU326與Lactobacillus kisonensis聚為一類，OTU5266和OTU227與Pediococcus ethanolidurans聚為一類，OTU7746與耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）聚為一類。由此可見，上述8個核心OTU中2個鑒定為Pediococcus，6個鑒定為Lactobacillus，因此，采集自恩施市的3種泡辣椒樣品中平均相對含量＞1.0%的核心菌群均為乳酸桿菌。

2.2 基于PCR-DGGE測序技術泡辣椒乳酸桿菌多樣性的研究

圖中L1～L5代表特異性條帶編號。圖4 泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE結果Fig. 4 PCR-DGGE results of Lactobacillus in the pickled chili samples

由于本研究中MiSeq高通量測序的靶點主要針對16S rRNA的V3～V4區(qū)，所以其引物通用性較強，在種屬鑒定時通常僅將其鑒定到屬水平。本研究進一步使用乳酸桿菌專用引物對樣品中的乳酸桿菌屬進行了PCR擴增，并結合PCR-DGGE技術對其多樣性進行解析。泡辣椒樣品中乳酸桿菌PCR-DGGE電泳結果如圖4所示。

由圖4可知，在電泳圖中共找到5條特異性條帶，其中條帶L1、L2、L4是3種泡辣椒樣品的共有條帶，條帶L5存在于泡辣椒樣品LJS01和LJS03中，但是各條帶的亮度不一致，說明同種微生物在不同樣品中的含量存在差異，而條帶L3只存在于泡辣椒樣品LJS03中。由此可見，不同泡辣椒樣品間乳酸桿菌多樣性存在一定差異，且泡辣椒樣品LJS03中乳酸桿菌多樣性較高。進一步對各優(yōu)勢條帶進行切膠回收和序列分析，結果如表2所示。

表2 DGGE中優(yōu)勢乳酸桿菌序列比對結果Table 2 Sequence alignment results of dominant Lactobacillus in DGGE

由表2可知，5個特異性條帶的基因序列與NCBI中模式菌株的基因序列具有較高的相似度（99%～100%）。條帶L1為植物乳桿菌（L.plantarum），條帶L2為L.namurensis，條帶L3為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum），條帶L4為耐酸乳桿菌（L.acetotolerans），條帶L5為短乳桿菌（L.breris）。由此可見，恩施市泡辣椒中乳酸菌多樣性較高，采用純培養(yǎng)技術對其中蘊含的乳酸菌菌種資源進行挖掘顯得尤為必要。

2.3 泡辣椒中乳酸菌分離鑒定結果及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對3種泡辣椒樣品中的乳酸菌進行分離鑒定。從3種泡辣椒樣品中共分離得到14株乳酸菌，編號分別為LJS01-1、LJS01-2、LJS01-3、LJS01-4、LJS01-6、LJS01-7、LJS02-1、LJS02-2、LJS02-4、LJS03-1、LJS03-2、LJS03-3、LJS03-5和LJS03-6。將各菌株與NCBI中同源性較高的模式菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖5所示。

由圖5可知，菌株LJS01-1、LJS01-3、LJS01-6、LJS01-7、LJS03-1、LJS03-5和LJS03-6與L.plantarum聚于一支，菌株LJS01-4、LJS02-2與L.fermentum聚于一支，菌株LJS02-1、LJS01-2、LJS02-4與屎腸球菌（Enterococcus faecium）聚于一支，菌株LJS03-2和LJS03-3與香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）聚于一支。因此，14株乳酸菌經16S rRNA基因序列鑒定，7株為L. plantarum，2株為L. fermentum，3株為E.faecium，2株為L.farciminis。

圖5 14株菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of 14 strains based on 16S rRNA gene sequences

通過純培養(yǎng)和分子生物學相結合的方法，本研究從泡辣椒樣品中分離出的乳酸菌主要為L.plantarum。利用傳統(tǒng)分子生物學及16S rRNA測序方法，王修俊等[23]在貴陽發(fā)酵辣椒中發(fā)現一株產酸能力較強、生長良好的優(yōu)勢菌株，經鑒定為L.plantarum；葉陵等[24]從自然發(fā)酵剁辣椒中共鑒定出5株乳酸菌，其中3株為L.plantarum、2株為L.breris。

3 結論

恩施市3種泡辣椒樣品中優(yōu)勢細菌門為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對含量分別為85.70%和12.59%；優(yōu)勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其平均相對含量高達67.37%。通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法共分離鑒定出14株乳酸菌，其中7株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、2株為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）、3株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、2株為香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis），表明優(yōu)勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。