柯 濤，周業(yè)皓，姜 鵬，李建武，馬向東*

（1.南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽473200；2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)院，湖北 武漢430062）

大曲是白酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑，白酒生產(chǎn)過程中大部分參與代謝的微生物都來源于大曲[1]。大曲在中國濃香型白酒生產(chǎn)過程中起著重要作用，改善大曲中微生物群落的結(jié)構(gòu)組成可以增進(jìn)大曲產(chǎn)生出許多有益風(fēng)味物質(zhì)[2]。傳統(tǒng)大曲生產(chǎn)是靠自然富集接種環(huán)境中各種微生物經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)而制成的，能利用原料生成大量不同種類的香味物質(zhì)或其前體物[3]。自然界中的微生物群體，除了酵母、根霉、曲霉、毛霉等有益菌外，也夾帶著許多對釀酒有害的菌類，這種傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的大曲受自然環(huán)境因素的制約大，造成質(zhì)量不穩(wěn)定、出酒率低、生產(chǎn)成本高等不利因素[4-5]。

強(qiáng)化大曲工藝的研究主要集中在如何強(qiáng)化方面，使用不同的有益菌株和不同的接種比例等。常見的菌種包括酵母，絲狀真菌及細(xì)菌等，行業(yè)通常也會將分離自釀造環(huán)境的功能微生物用于強(qiáng)化制曲，也取得了較好的效果。大曲在完成糖化、發(fā)酵功能之后，就是酯化生香過程，是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大曲酒的關(guān)鍵階段，因此大曲的質(zhì)量評定指標(biāo)中，酯化力的高低是一個非常重要的指標(biāo)。傅金泉等[6-7]在大曲培養(yǎng)中加入酯化紅曲霉，制備酯化率較高的強(qiáng)化大曲，生產(chǎn)應(yīng)用效果顯著。產(chǎn)酯酵母又稱為生香酵母，是指產(chǎn)酯能力強(qiáng)的酵母菌總稱，主要產(chǎn)乙酸乙酯，是形成白酒香味成分的主要菌群[8]。馮雅芳等[9]將酵母菌、黑曲霉和紅曲霉混合培養(yǎng)加入大曲中。顏林春[10]將篩選到的10株功能芽孢桿菌經(jīng)純種培養(yǎng)后加入在制曲原料中制成強(qiáng)化高溫大曲，檢測符合一級高溫大曲質(zhì)量控制指標(biāo)。

本研究為改進(jìn)大曲制作工藝，獲得性能穩(wěn)定具有獨(dú)特風(fēng)味的大曲，首先分離醬香型白酒釀造環(huán)境的產(chǎn)香型功能細(xì)菌，確定其產(chǎn)香組分，與酯化紅曲和產(chǎn)酯酵母共同制作復(fù)合菌劑用于強(qiáng)化制曲，并對大曲理化指標(biāo)和感官指標(biāo)的動態(tài)變化及香味組分變化進(jìn)行了檢測和比較分析，初步探討強(qiáng)化接種對大曲品質(zhì)的影響，通過人工接種純菌方式生產(chǎn)強(qiáng)化大曲，可以抑制有害雜菌的生長，提高產(chǎn)品質(zhì)量，減少用曲量等，對釀酒工藝的改進(jìn)有著極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

郎比可假絲酵母菌（Candida lambica）AS2.1182：中國科學(xué)院菌種保藏中心；酯化紅曲：自市售商品中分離；產(chǎn)香細(xì)菌：本實(shí)驗(yàn)室篩選；普通大曲：賒店老酒股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏（均為生化試劑）、無水乙醚、甲醇、乙醇、乙醚、正己烷（均為色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，瓊脂粉1.5%。121 ℃滅菌30 min。倒平板之前，每200 mL培養(yǎng)基加入兩性霉素B（5 mg/mL）100 μL以抑制真菌生長。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%。121 ℃滅菌30 min。

麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮4 g，面粉1g，水10 mL。麩皮液體培養(yǎng)基：麩皮2 g，面粉0.5 g，水30 mL。115 ℃滅菌20 min。

酵母霉菌（yeast and mould，YM）瓊脂培養(yǎng)基：酵母粉0.3%、蛋白胨0.5%、麥芽糖0.5%、葡萄糖1%、瓊脂2%、乳酸（50 μL/10 mL；倒平板前加入）、氯霉素（80 μL/100 mL），105 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國安捷倫公司；DB-Wax毛細(xì)管柱（20 m×0.18 mm×0.8 μm）：賽默飛世爾（中國）科技公司；PAL System三合一進(jìn)樣器：瑞士CTC公司；100 μm PDMS萃取纖維頭：美國Supelco公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器公司；BPC-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-50S11壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)香細(xì)菌的篩選

在白酒生產(chǎn)發(fā)酵堆積過程中，每隔12 h從發(fā)酵堆中不同位點(diǎn)取樣直至堆積發(fā)酵結(jié)束。取樣點(diǎn)為離地1 m的發(fā)酵堆表層下20～30 cm堆積層面處，分別在發(fā)酵堆的4處取樣并混勻，新鮮樣品直接轉(zhuǎn)入無菌袋中密封，立即置于4 ℃冰箱保存。使用LB 固體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基從樣品中分離出優(yōu)勢可培養(yǎng)細(xì)菌。對固體發(fā)酵樣品產(chǎn)生的香味進(jìn)行描述，并對呈香為甜香、果香、特殊香的菌株做標(biāo)記。感官鑒定人員為本實(shí)驗(yàn)室具有一年以上聞香經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對產(chǎn)香細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物分析

3株產(chǎn)香細(xì)菌菌株在37 ℃條件下固態(tài)發(fā)酵8 d，6 000×g、10 ℃低溫離心15 min，收集發(fā)酵液，用氯化鈉飽和發(fā)酵液，加二氯甲烷（沸點(diǎn)40 ℃）進(jìn)行多次萃取，分離兩相，萃取液加無水硫酸鈉粉末干燥，35 ℃加熱濃縮萃取液至1 mL，0.45 μm濾器過濾樣品，采用GC-MS法分析揮發(fā)性成分。

氣相色譜條件：使用DB-Wax毛細(xì)管柱（20 m×0.18 mm×0.8 μm），程序升溫條件：初溫50 ℃，恒溫2 min，然后以20 ℃/min的速率升至230 ℃，保持30 min。進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流；載氣：氦氣（He）；流速：2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；溶劑延遲4 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量：70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描范圍：30～550 amu[11-13]。

定性定量方法：樣品中未知揮發(fā)性成分通過工作站美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫自動檢索，導(dǎo)出樣品檢索報(bào)告后篩選匹配，保留匹配度＞80的物質(zhì)。定量分析采用峰面積歸一化法，計(jì)算出各種保留揮發(fā)性成分的相對百分含量。

1.3.3 細(xì)菌的16S rDNA分子鑒定

分別提取保存的純培養(yǎng)細(xì)菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），采用細(xì)菌通用引物27F和1492R對細(xì)菌總DNA進(jìn)行16S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后，送由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 產(chǎn)香細(xì)菌種子液的制備

取上述篩選的產(chǎn)香細(xì)菌菌種，于LB試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，在溫度37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h；轉(zhuǎn)接入三角瓶麩皮培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在溫度37 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，制成細(xì)菌二級種子；將細(xì)菌二級種子轉(zhuǎn)接入淺盤麩皮培養(yǎng)中，在溫度25 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h，即制成細(xì)菌三級種子。

1.3.5 產(chǎn)酯酵母種子的制備

取市售產(chǎn)酯酵母菌種郎比可假絲酵母菌AS2.1182于麥芽汁試管斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)48 h；轉(zhuǎn)接入三角瓶麩皮固體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在溫度30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，即制成產(chǎn)酯酵母功能種子曲二級種子，將產(chǎn)酯酵母功能種子曲二級種子轉(zhuǎn)接入淺盤麩皮培養(yǎng)基中，在溫度37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，即制成產(chǎn)酯酵母三級種子。

1.3.6 酯化紅曲種子液的制備

取市售的酯化紅曲菌種[14]于PDA試管斜面培養(yǎng)，在溫度32 ℃條件下培養(yǎng)5 d；轉(zhuǎn)接入三角瓶麩皮固體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，在溫度32 ℃條件下培養(yǎng)5 d，即制成酯化紅曲功能種子曲二級種子，將酯化紅曲功能種子曲二級種子轉(zhuǎn)接入淺盤麩皮培養(yǎng)中，在溫度32 ℃條件下培養(yǎng)5 d，即制成酯化紅曲三級種子。

1.3.7 曲母粉的制備

將傳統(tǒng)中高溫大曲成品優(yōu)質(zhì)曲粉碎，過40目篩，去除雜質(zhì)后作為曲母，備用。

1.3.8 增香高酯強(qiáng)化中高溫大曲的生產(chǎn)方法

種曲培養(yǎng)基制備：使用無雜質(zhì)、無霉變的優(yōu)質(zhì)小麥為原料，用室溫水潤糧，控制潤麥后小麥的含水量為15%～20%。將潤好后的糧食進(jìn)行粉碎，小麥粉碎至爛心不爛皮，即麥皮磨成片狀，麥心磨成粉末，粉碎粒度要求未通過40目篩的粗皮及顆粒占45%～55%。然后水分調(diào)節(jié)至37%～40%，即制成種曲培養(yǎng)基[15]。

接種：將增香細(xì)菌種子（接種質(zhì)量比分別為0.05%、0.10%、0.15%）、產(chǎn)酯酵母種子（接種質(zhì)量比分別為0.5%，1.0%，1.5%）、酯化紅曲種子（接種質(zhì)量比分別為0.5%，1.0%，1.5%）、曲母粉（接種質(zhì)量比分別為0.5%，1.0%，1.5%）接種于種曲培養(yǎng)基中，并攪拌均勻；其余為種曲培養(yǎng)基[10-11]。

壓曲塊：制曲在河南賒店老酒公司制曲車間完成。將接種完成的培養(yǎng)基混合物送入壓曲機(jī)中，用模具控制將培養(yǎng)基混合物壓制成大曲塊（28 cm×15 cm×7 cm）[15]。

自然發(fā)酵：將壓制成型的大曲塊堆碼在發(fā)酵室內(nèi)，塊間留有2 cm，行間留有3 cm通風(fēng)間隙；初始培養(yǎng)溫度設(shè)為冬季10～19 ℃，夏季15～25 ℃，初始濕度設(shè)為85%，曲塊經(jīng)過6～20 d自然升溫后，曲心最高溫度達(dá)62～65 ℃，此階段持續(xù)6～8 d；之后待曲塊溫度回落至室溫，將曲塊傳送至庫房，貯存3 個月后出庫，即制成增香高酯強(qiáng)化中高溫大曲[16]。普通大曲除不接種菌種外用相同工藝生產(chǎn)。

1.3.9 大曲感官及主要理化指標(biāo)檢測

參照文獻(xiàn)[17]，制曲企業(yè)組織3名技術(shù)人員對入庫曲坯進(jìn)行感官評價(jià)并評分；參照文獻(xiàn)[18]測定各曲心樣品的酸度、糖化力、液化力、發(fā)酵力等理化指標(biāo)。

1.3.10 大曲樣品氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

取5 g大曲樣品置于20 mL頂空瓶中，壓緊瓶蓋。于55 ℃條件下頂空40 min后，用固相微萃取針萃取20 min。（萃取針使用前在250 ℃老化10 min，冷卻到室溫后依次用甲醇、乙醇、乙醚、正己烷、去離子水、甲醇清洗）手動進(jìn)樣，萃取針在進(jìn)樣口停留5 min。

氣相色譜條件：TG-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：240 ℃，柱箱溫度為50 ℃；升溫程序：起始溫度為50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min，升至240 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，能量70 eV，倍增電壓1 400 V；離子源溫度：250 ℃，接口溫度：250 ℃；掃描范圍：40～450 m/z，間隔0.3 s[19-20]。

定性定量方法同1.3.2節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香細(xì)菌的篩選與揮發(fā)性組分分析

在白酒生產(chǎn)發(fā)酵堆積過程中取樣獲得共98株細(xì)菌進(jìn)行為期2周的固體發(fā)酵，每隔一周進(jìn)行一次感官鑒定。感官鑒定初篩表明，多數(shù)菌株發(fā)酵后呈霉豆渣味，少數(shù)呈甜香、果香和特殊香型，發(fā)酵第二周出現(xiàn)了少數(shù)醬香香型。經(jīng)過感官鑒定復(fù)篩，綜合鑒定人員意見，確定香味較為濃郁、舒適、穩(wěn)定的呈甜香、果香、特殊香味的產(chǎn)香細(xì)菌有3株（BLM2、BLM3、BLM1）。以不接菌的麩皮培養(yǎng)基為對照，將此3株細(xì)菌和1株對照細(xì)菌C11進(jìn)行固體發(fā)酵，樣品經(jīng)液液萃取處理后采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析揮發(fā)性香味成分，揮發(fā)性成分檢測結(jié)果見表1。

表1 3株產(chǎn)香細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中部分可揮發(fā)性化合物的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Results of GC-MS analysis of volatile compounds in solid-state fermentation products of 3 aroma producing bacteria

續(xù)表

由表1可知，菌株BLM2和BLM3產(chǎn)生的風(fēng)味化合物的種類多于菌株BSM1，包括醇類、芳香類化合物、內(nèi)酯類、呋喃類、醛類、酮類、酯類等。菌株BSM1有較高的產(chǎn)三甲基吡嗪和四甲基吡嗪的能力，同時(shí)也有產(chǎn)生較高甘油、多肽類等物質(zhì)的能力。菌株BLM2和BLM3檢測到了二甲基吡嗪（具有烘烤、堅(jiān)果、可可等香氣）和三甲基吡嗪等多種吡嗪類化合物的產(chǎn)生能力，菌株BLM3還產(chǎn)生了另一種醬香型酒主體香味物質(zhì)——乙偶姻（奶油香味），含量高達(dá)3.8%。經(jīng)過16S rDNA測序結(jié)果表明3株菌分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BSM1，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLM2，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLM3。

2.2 增香高酯強(qiáng)化大曲的生產(chǎn)工藝

大曲是一個含有多菌系、多酶系與復(fù)雜香氣物質(zhì)的整體，因此強(qiáng)化大曲制曲工藝要與傳統(tǒng)大曲發(fā)酵工藝相結(jié)合，既要保持原有制曲工藝不做大的改動，又能賦予大曲更多復(fù)雜的香氣物質(zhì)。分批試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)酯酵母種子、酯化紅曲種子和曲母粉添加量＞1.0%時(shí)，會造成培菌初期發(fā)酵溫度上升過快，需要調(diào)整曲塊間距，并且部分曲塊容易變形，增加了操作困難。而添加量＜0.5%時(shí)效果不明顯，所以最終確定產(chǎn)酯酵母種子、酯化紅曲種子和曲母粉的添加量為1.0%。由于中高溫大曲中原細(xì)菌總量就占優(yōu)勢，為了不影響產(chǎn)酯酵母菌的良好生長，因此產(chǎn)香細(xì)菌的添加量要更小，將3株產(chǎn)香細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)制得種子后混合，添加量分別為0.05%、0.10%、0.20%、0.30%，得到不同批次曲塊，記錄曲塊發(fā)酵升溫情況，得出產(chǎn)香細(xì)菌的添加量為0.10%，對成熟曲塊的制曲工藝參數(shù)影響不大。因此經(jīng)過多次反復(fù)的試驗(yàn)與論證，產(chǎn)香細(xì)菌種子、產(chǎn)酯酵母種子、酯化紅曲種子和曲母粉最佳接種質(zhì)量比分別為0.1%、1.0%、1.0%和1.0%，其余為種曲培養(yǎng)基。在此條件下制曲，獲得強(qiáng)化曲與對照曲曲心溫度變化曲線見圖1。

圖1 強(qiáng)化曲與普通曲的曲心溫度變化曲線Fig. 1 Change curves of central temperature of fortified Daqu and common Daqu

由圖1可知，由于添加了一定比例的功能微生物和曲母，因此強(qiáng)化曲前期升溫比較快，為避免影響曲塊成型，強(qiáng)化曲在操作時(shí)會適當(dāng)加大曲塊之間的間距。工藝微調(diào)后，強(qiáng)化曲總體的發(fā)酵情況與對照相似，符合“前緩、中挺、后緩落”的變化規(guī)律。前期升溫速度比普通曲略高，都在第10天左右升至頂火溫度，強(qiáng)化曲頂火時(shí)間可維持時(shí)間較長，落火階段也是緩慢落火。制備的強(qiáng)化大曲相對傳統(tǒng)曲菌絲更為飽滿，曲香更加突出、濃郁。對普通大曲與增香高酯強(qiáng)化大曲的顏色、香味等感官指標(biāo)及理化指標(biāo)進(jìn)行對比，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 強(qiáng)化大曲與普通大曲感官指標(biāo)比較Table 2 Comparison of sensory indexes between fortified Daqu and common Daqu

表3 強(qiáng)化大曲與普通大曲理化指標(biāo)比較Table 3 Comparison of physicochemical indexes between fortified Daqu and common Daqu

由表2可知，普通大曲與強(qiáng)化大曲在顏色上區(qū)別很小，都有著較濃的大曲特有的香味，皮張差別也不大，大曲的斷面都較整齊，菌絲豐滿，生長健壯，不同的是增香高酯強(qiáng)化大曲的斷面菌絲更亮。從感官指標(biāo)來看，增香高酯強(qiáng)化大曲符合濃香大曲的優(yōu)級標(biāo)準(zhǔn)。

由表3可知，增香高酯強(qiáng)化大曲理化指標(biāo)中，糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力等重要指標(biāo)比普通大曲都有明顯提高，尤其是酯化力提升明顯。

2.3 增香高酯強(qiáng)化大曲的產(chǎn)香成分檢測結(jié)果

通過頂空-固相微萃取后按照氣質(zhì)聯(lián)用法分析檢測，采用面積歸一化法計(jì)算組分相對含量[19]，普通大曲和增香高酯強(qiáng)化大曲香味成分檢測結(jié)果見表4。

表4 強(qiáng)化大曲與普通大曲香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 4 Results of GC-MS analysis of aroma compounds in fortified Daqu and common Daqu

續(xù)表

由表4可知，兩種大曲共鑒定出香味物質(zhì)50種，主要分為6大類化合物，其中包括酸類、醛類、醇類、酯類、吡嗪類、芳香族類、烷烴類、萜烯類化合物等。其中普通大曲醛類、醇類和酸類物質(zhì)相對含量比增香高酯強(qiáng)化大曲高，尤其是醇類物質(zhì)含量高，種類多；而酯類、吡嗪類、芳香族類、烷烴類，萜烯類化合物強(qiáng)化大曲明顯比普通大曲種類多，含量高。其中D-檸檬烯含量最高，增香高酯強(qiáng)化大曲為41%，而普通大曲為33.1%。強(qiáng)化大曲還檢測到吡嗪類物質(zhì)，而普通大曲無此類成分。

3 結(jié)論

本研究在傳統(tǒng)濃香型白酒生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，通過接種產(chǎn)香細(xì)菌、酯化紅曲，產(chǎn)酯酵母等特殊產(chǎn)香產(chǎn)酯菌類和曲母粉，加入強(qiáng)化中高溫大曲生產(chǎn)，希望通過改變中高溫大曲中的微生物種類和比例，增加大曲中特殊香味成分和酯化力，同時(shí)能提高大曲的品質(zhì)和優(yōu)質(zhì)品率。通過初篩和復(fù)篩，從白酒發(fā)酵堆積產(chǎn)物中篩選到3株特殊產(chǎn)香細(xì)菌，通過GC-MS檢測表明3株細(xì)菌都有產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的能力。通過優(yōu)化大曲中的菌種加入比例，得到的大曲通過感官和理化性質(zhì)評測均優(yōu)于原大曲，且能維持較長的頂點(diǎn)溫度。通過GC-MS分析表明大曲中的香味成分組成比例和種類都和普通大曲有所區(qū)別，也檢測到了吡嗪類物質(zhì)。強(qiáng)化大曲的酯類，吡嗪類，芳香族類，烷烴類，萜烯類化合物等明顯比普通大曲種類多，含量高，其中D-檸檬烯含量最高，強(qiáng)化大曲為41%，而普通大曲為33.1%。使用本強(qiáng)化中高溫大曲到濃香型釀酒生產(chǎn)中，預(yù)期可以適當(dāng)增加中高溫大曲醬香味，改善濃香型白酒的香味物質(zhì)組成，增加了河南地域濃香型白酒香味的豐富性。