任浪浪，唐志書，梁艷妮，劉力，宋忠興，黃文靜，王征

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室/陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712083

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種非特異性的炎癥性疾病，涉及黏膜和大腸黏膜下層直腸。在特殊情況下，定義為全腸炎，可能會影響整個大腸[1]。臨床表現(xiàn)主要為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，內(nèi)鏡下結(jié)腸呈糜爛、潰瘍等彌漫性炎癥，組織病理學(xué)表現(xiàn)為黏膜或黏膜下彌漫性炎癥反應(yīng)、杯狀細胞減少、隱窩結(jié)構(gòu)破壞[2-3]。研究報道顯示UC的發(fā)生與體內(nèi)抑炎因子、促炎因子的失衡密切相關(guān)。炎癥細胞因子異常增多或抑炎細胞因子異常減少均可促進腸黏膜炎癥的變化，而持久的免疫調(diào)節(jié)失衡則促使炎癥趨于慢性化[4]。潰瘍性結(jié)腸炎活動期白細胞介素-10(IL-10)表達水平降低[5]，腫瘤壞死因子(TNF-α)表達水平升高，使體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)失衡，從而誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎[6]。目前我國UC發(fā)病呈上升趨勢。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，馬齒莧多糖對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型具有很好的治療作用，可明顯改善小鼠結(jié)腸的病理結(jié)構(gòu)，平衡體內(nèi)炎癥因子和抑炎因子的水平。有文獻報道，肉桂水提液對UC有很好的療效[8]。我校國家中醫(yī)藥管理局脾胃病重點學(xué)科學(xué)術(shù)帶頭人劉力教授在30多年的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，馬齒莧-肉桂聯(lián)用對治療UC具有良好效果，但其作用機理尚未明確，目前也沒有關(guān)于馬齒莧-肉桂聯(lián)用治療UC的文獻報道。故本課題組對馬齒莧-肉桂聯(lián)用的最佳配比及其治療UC的作用進行研究。

1 材料

1.1 儀器

電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計UV-2006(島津有限公司)；FA2004B型電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；IMS-50制冰機(常熟市雪科電器有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan GO)-1510 (Thermo Fisher)。

1.2 材料

1.3 動物

昆明種SPF級雄性小鼠60只，體質(zhì)量(20±2)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證許可證號：SCXK(陜)2017-003。

2 方法

2.1 馬齒莧-肉桂聯(lián)用提取工藝研究

前期研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖對UC小鼠具有確切的治療作用，故馬齒莧-肉桂聯(lián)用最佳配比評價采用馬齒莧多糖含量為指標(biāo)，以臨床常用配比馬齒莧-肉桂(12∶5)為參照。

2.1.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用苯酚-硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]，得回歸方程為Y= 5.461 6X+ 0.092 3(r= 0.999 3)，線性范圍為0.025～0.15 mg·mL-1。

2.1.2 多糖提取率的計算 根據(jù)不同的提取工藝進行提取，將提取液濃縮至黏稠狀冷凍干燥，稱取0.010 g凍干樣品，純凈水定容至100 mL，即得樣品供試液；精確吸取供試液1 mL，用紫外分光光度法在490 nm處測得吸光度A值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求多糖濃度，計算凍干樣品中多糖的含量。多糖提取率為多糖占馬齒莧配伍肉桂原藥材質(zhì)量的百分比。

2.1.3 馬齒莧-肉桂配比對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、提取溫度100 ℃、用水提取4 h的條件下，考察馬齒莧-肉桂不同配比對多糖提取率的影響。

2.1.4 料液比對多糖提取率的影響 在馬齒莧-肉桂配比12∶5、提取溫度100 ℃、用水提取4 h的條件下，考察不同料液比對多糖提取率的影響。

2.1.5 提取溫度對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、馬齒莧-肉桂配比12∶5、用水提取時間4 h的條件下，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。

3.談判技術(shù)。談判是指有關(guān)組織或個人以口頭語言為載體，對涉及自身利益的分歧和沖突進行反復(fù)磋商，尋求解決途徑和謀求達成協(xié)議的過程，它是知識、信息、口才、修養(yǎng)等諸方面的較量和角逐。［3］人類社會誕生至今就無時無刻不充斥著利益沖突，在這個意義上，人類的歷史就是一部談判的歷史。

2.1.6 提取時間對多糖提取率的影響 在料液比1∶40、馬齒莧-肉桂配比12∶5、提取溫度100 ℃的條件下，考察不同提取時間對多糖提取率的影響。

2.1.7 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標(biāo)，以L9(34)進行正交試驗[10]，正交試驗因素水平見表1。

表1 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗因素水平表

2.2 動物實驗

2.2.1 分組及給藥方法 昆明種雄性小鼠60只，隨機分6組(每組小鼠體質(zhì)量進行方差分析，P>0.05)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分為空白組、UC模型組、柳氮磺胺吡啶組[11]、馬齒莧-肉桂低中高劑量組?？瞻捉M小鼠飲用純凈水，其他小鼠自飲3%DSS 9 d誘導(dǎo)UC模型[12]，造模第1天起記錄小鼠的體質(zhì)量、大便質(zhì)地、潛血或便血特征[13-15]，根據(jù)表3進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分。

UC模型建立成功，第10天開始給藥治療，空白組和模型組灌胃5% 0.9%氯化鈉溶液，每天1 mL；柳氮磺胺吡啶組灌胃300 mg·kg-1的柳氮磺胺吡啶混懸液；馬齒莧-肉桂低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液(馬齒莧-肉桂的水提粉末依據(jù)最優(yōu)多糖提取率19%換算而成)[16]，每天1 mL；灌胃7 d，最后一次灌胃完禁食1 d。乙醚麻醉，眼眶取血，3000 r·min-1離心10 min，吸取血清，-20 ℃保存，待測ELISA試劑盒使用；距離肛門5 cm處取小鼠結(jié)腸段約1 cm，4%多聚甲醛保存。

2.2.2 石蠟包埋和HE染色 將保存的結(jié)腸組織取出后在流水中沖洗1 h，再將組織標(biāo)本放入乙醇中梯度脫水各1 h，再用二甲苯(2缸)透明1 h，然后將透明后的標(biāo)本放置在65 ℃熔解狀態(tài)的石蠟中1 h，浸透后取出組織放置于包埋模具內(nèi)熔蠟填充制得石蠟塊，并放于病理冷凍臺15 min后取下固定于切片機標(biāo)本架上，進行4 μm厚度連續(xù)切片，將切片放入45 ℃的恒溫水浴箱中使其充分鋪開以裱片，然后移入60 ℃恒溫干燥箱中2 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

病理HE染色，將烤好的切片用二甲苯脫蠟2次(每次15 min)，然后依次放入濃度梯度的乙醇和蒸餾水中各8 min，再將切片移入蘇木素染液中3 min，然后用流水洗去蘇木素染液終止染色，待其干后放入1%鹽酸乙醇溶液分化3 s，再以流水沖洗10 min后返藍25 min，然后放入伊紅液染色2 min并快速水洗以終止染色，最后將切片依次放入濃度梯度的乙醇中脫水5 min后，放入二甲苯透明2次(每次 3 min)后擦去殘余的二甲苯，滴加中性樹膠并蓋玻片封片固定。在微鏡下觀察比較各組大鼠HE染色結(jié)腸組織損傷的病理變化，并予評分比較(HAI=上皮組織破壞分?jǐn)?shù)+炎性浸潤分?jǐn)?shù))。具體參考Cooper等[17]的評分標(biāo)準(zhǔn)予以分析比較，見表2。

表2 大鼠結(jié)腸組織HAI病理變化評分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.3 DAI評分標(biāo)準(zhǔn) DAI=(體質(zhì)量下降評分+大便性狀評分+大便隱血情況評分)/3，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 DAI評分表

注：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛口的，糊狀或半成形大便；稀便：可黏附于肛門的稀水樣便。采用聯(lián)苯胺法檢測大便隱血。

2.2.4 IL-10、TNF-α含量測定 按照小鼠ELISA試劑盒說明書測定小鼠血清中IL-10、TNF-α的含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗

根據(jù)表4～7結(jié)果，可以得出馬齒莧和肉桂12∶5時，提取率較高；料液比1∶40時提取率最高；隨著溫度的升高，提取率也在上升；提取時間1、2、4、5 h時，提取率增加幅度很小；提取2～4 h時，隨著提取時間的延長，提取率增加。

表4 馬齒莧-肉桂配比對多糖提取率的影響

表5 料液比對多糖提取率的影響

表6 提取溫度對多糖提取率的影響

表7 提取時間對多糖提取率的影響

3.2 正交試驗

由表8正交試驗結(jié)果得出最優(yōu)工藝是A3B1C3D2，即馬齒莧和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取時間5 h，提取溫度90 ℃。由R值可以看出C(提取時間)因素對多糖提取率的影響最大。4個因素對多糖提取率影響的大小如下：C(提取時間)>B(料液比)>D(提取溫度)>A(配比)；表9方差結(jié)果分析可得出4個因素間無統(tǒng)計學(xué)差異，從提取效率角度選用方案為馬齒莧和肉桂12∶5、料液比1∶30、提取時間5 h、提取溫度90 ℃。

表8 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表9 馬齒莧-肉桂提取工藝正交試驗方差分析

注：F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99。

3.3 最優(yōu)工藝的確定

根據(jù)正交試驗的最優(yōu)工藝進行提取，平行實驗3次，測其多糖提取率，結(jié)果多糖提取率分別為18.85%、19.14%、19.27%，RSD=0.92%。結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定。

3.4 DAI評分結(jié)果

根據(jù)表3小鼠DAI評分表，得出表10評分結(jié)果，小鼠自飲3% DSS 9 d后各實驗組DAI評分均升高，表明小鼠造模成功，第10天灌胃治療，給藥組小鼠DAI評分均呈下降趨勢，且隨給藥濃度的增大，小鼠DAI評分下降趨勢更明顯，然而不及陽性對照藥的療效，表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC有療效，且比馬齒莧單味藥的療效更確切[6]。

表10 馬齒莧-肉桂配伍各組小鼠的DAI評分 分

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.5 炎癥因子的變化

由表11可知，模型組血清中抑炎因子IL-10的含量較空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，促炎因子TNF-α含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。給藥后，馬齒莧-肉桂低、中劑量組IL-10的含量較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且高于陽性對照組，相比馬齒莧單味藥治療，IL-10的含量增加很多[6]；馬齒莧-肉桂低、中、高劑量組TNF-α含量較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，相比馬齒莧單味藥治療，TNF-α的含量降低幅度更明顯[7]，較柳氮磺胺吡啶組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用能顯著改變UC小鼠炎癥因子的含量，且比馬齒莧治療效果更佳，治療效果與陽性對照藥無明顯差異。

表11 馬齒莧-肉桂配伍各組小鼠IL-10、TNF-α含量的變化 pg·mL-1

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.6 結(jié)腸組織觀察

乙醚麻醉，處死小鼠，從肛門以上5 cm處取出小鼠結(jié)腸段約1 cm，發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠結(jié)腸顏色為淡紅色，腸管內(nèi)充滿成形糞便。DSS模型組小鼠結(jié)腸腸壁充血腫脹，嚴(yán)重者整個結(jié)腸段為血性腸內(nèi)容物。給藥組小鼠可見基本成型糞便，結(jié)腸腸壁有輕微充血。從圖1、2進一步得出：空白組結(jié)腸組織完整，包括黏膜層、黏膜下層、肌層，可見明顯的隱窩和杯狀細胞，腺體排列整齊；DSS誘導(dǎo)的UC模型組，部分腸黏膜層不完整脫落，隱窩和杯狀細胞明顯減少，有大量炎癥因子，主要是中性粒細胞侵入黏膜層，HAI評分明顯高于空白組，表明UC模型誘導(dǎo)成功；陽性對照組柳氮磺胺吡啶治療后，結(jié)腸結(jié)構(gòu)相對完整，有大量杯狀細胞和隱窩出現(xiàn)，但黏膜層仍有少量炎癥細胞，HAI評分顯著降低，表明磺胺吡啶300 mg·kg-1可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀，然而，炎癥細胞浸潤對結(jié)腸組織的損傷并沒有完全消除；馬齒莧-肉桂給藥100、200、400 mg·kg-1的多糖水溶液治療，可見結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，有隱窩和大量杯狀細胞出現(xiàn)，但仍有少量炎癥細胞浸潤，HAI評分較模型組顯著降低，但不及陽性藥的療效，表明馬齒莧-肉桂可修復(fù)UC結(jié)腸組織，但是不能完全消除炎癥因子對結(jié)腸組織的損傷。相比汪荔[7]研究，雖給藥量減少，然而治療效果卻得到很大的改善，進一步表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC療效甚好。

圖1 小鼠結(jié)腸組織HE染色圖(×400，橫切)

注：與UC模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較，##P<0.01，#P<0.05。圖2 小鼠結(jié)腸組織病理切片HAI評分(n=6)

4 討論

多糖提取工藝從馬齒莧-肉桂的配比、料液比、提取時間、提取溫度4個因素研究，以多糖提取率為考察指標(biāo)篩選最優(yōu)實驗方案。即馬齒莧和肉桂12∶5，料液比1∶30，提取時間5 h，提取溫度90 ℃為最優(yōu)提取工藝條件。用3%DSS誘導(dǎo)昆明種小鼠UC模型，從DAI評分可得出小鼠給藥后體征恢復(fù)正常；病理切片可看出小鼠給藥后結(jié)腸組織有所改善；炎癥因子數(shù)據(jù)表明小鼠給藥前后抑炎因子和促炎因子的變化，進一步證實藥物對小鼠UC模型有治療作用。

前期課題組研究了馬齒莧對DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠有確切的治療作用，可明顯改善小鼠結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)。馬齒莧性寒，多糖是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[18]，具有“天然抗生素”的美稱[19]。馮瀾等[20]研究表明馬齒莧多糖可以提高抗炎細胞因子 IL-10 的水平并降低致炎細胞因子 TNF-α、IL-6 的水平，同時可以提高雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量，因此馬齒莧多糖通過抗炎和降低腸道過度的免疫反應(yīng)以及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)，對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。肉桂性辛、甘、熱，其所含的成分如總酚類物質(zhì)、槲皮苷、山柰酚被證明無論在體內(nèi)還是體外試驗中均具有很好的抗腫瘤作用[21]。有研究表明肉桂對潰瘍性結(jié)腸炎治療作用的分子機制可能是由于其對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的抑制。馬齒莧性寒，單味藥治療UC不能發(fā)揮其最大的療效，因此配伍肉桂研究了馬齒莧-肉桂最佳提取工藝、3%DSS誘導(dǎo)UC模型，小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)、DAI評分、IL-10和TNF-α的含量變化、結(jié)腸組織病理切片，表明馬齒莧-肉桂聯(lián)用對UC有療效，且比馬齒莧單味藥療效更佳[6]。我國UC患者逐年上升，因此研發(fā)有效安全、不良反應(yīng)小的藥物尤為重要。本實驗僅研究了提取工藝及其在動物水平的療效，在今后將研究其在細胞、分子和基因水平的治療機制，為我國治療UC提供更多選擇。